肿瘤  2008, Vol.28 Issue (3): 228-231   PDF    
实时荧光定量-PCR法检测6种肺癌细胞系中吉西他滨耐药相关基因的表达
林 莉1, 刘晓晴1 , 王伟霞1, 王升启2, 宋三泰1    
1. 军事医学科学院附属三〇七医院全军肿瘤中心肺癌内科, 北京 100071;
2. 军事医学科学院放射医学研究所生物技术实验室, 北京 100850
[摘要]    目的: 研究6株肺癌细胞系中吉西他滨耐药相关基因的表达及吉西他滨的细胞毒作用,探讨对吉西他滨的耐药机制.方法: 提取人肺腺癌细胞GLC-82,NCI-H 460和A 549,人低转移和高转移的肺大细胞癌细胞95-C和95-D以及人鳞状上皮癌细胞QG 56等6株肺细胞系的总RNA,反转录为cDNA, 以β-actin作内对照,采用RFQ-PCR(real-time fluorogentic quantitative ,PCR)检测RRM 1,PTEN,ERCC 1,dCK,CDA这5种基因在这些细胞中的表达情况,并用MTT法检测吉西他滨对各株细胞系的IC50值.结果: 在6株肺癌细胞中肺鳞癌QG 56细胞RRM1,PTEN,ERCC1 mRNA的表达最高,dCK和CDA mRNA的表达在各株细胞中的差异无统计学意义,吉西他滨对QG56细胞的IC50值最高.结论: RFQ-PCR方法可以应用于肿瘤细胞基因的检测;RRM1与PTEN,ERCC1 mRNA的表达有相关性,RRM1 mRNA的高表达与吉西他滨耐药相关.
[关键词]     癌, 非小细胞肺    抗药性, 肿瘤    基因表达    
Detection of gemcitabine-resistant genes expression in six lung cancer celllines using real-time fluorogentic quant-itative PCR
LIN Li1, LIU Xiao-Qing1 , WANG Wei-xia1, WANG Sheng-Qi2, SONG San-Tai1    
1. Department of Lung Cancer Medicine,Cancer Center of PLA Affiliated 307 Hospital, Academy ofM ilitary Medical Sciences, Beijing 100071, China;
2. Laboratory of Biotechnology, Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China
[Abstract]    Objective: To quantify the expression of gemcitab ine-resistant genes in six lung cancer cell lines, study the cytotox iceffects of gemc itabine, and reveal themechanism for the resistance of lung cancer ce lls to gemc itab ine. Methods: The total RNA wasex tracted from human lung adenoma cells (GLC-82, NC I-H460, and A549), human g ian-t cell lung cancer 95-C (low metasta tic), 95-D(high me tastatic) and human squamous lung cancer cells (QG56). Then the cDNA was amp lified by rea-ltmie fluo rogentic quantitativePCR. B-actin w as used as an interna l contro.l Expression of ribonucleotide reduc taseM 1 (RRM 1), phospha tase and tensin homo loguedeleted on chromosome 10 (PTEN), exc ision repair cross-complemen tation 1 (ERCC-1), dCK, and CDA was detected byRFQ-PCR.Cyto tox ic ity w asmeasured w ithMTT assay and IC50 was calculated. Results: The expression of RRM 1, PTEN, and ERCC1 were all theh ighest in QG56 ce ll line in the six cell lines. The expressions of dCK and CDA mRNA had no significant difference among the six celllines. IC50 of gemcitabine was the highest fo rQG56 cells. Conclusion: RFQ-PCR could be used formonito ring the gene expression intumo r cell lines. The mRNA expression of RRM 1 corre lated with the expression of PTEN /ERCC1.
[Key words]     Carcinoma, non-small celllung    Drug resistance, neoplasm    Gene expression    

吉西他滨为非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer,NSCLC)第3代化疗药物的代表之一[1],但其单药治疗初治或既往化疗失败患者的总有效率仅为20%左右,耐药是束缚其临床应用的重要原因之一[2]。研究表明RRM1(ribonucleotide reductasesubunitM1),PTEN(phosphatase and tensin homologdeleted on chromosome ten) ,ERCC 1(excision repaircross complemention 1),dCK(deoxycytide kinase),CDA(cytidine deam inase)基因可能参与了吉西他滨的耐药过程。为了解吉西他滨的耐药机制,本研究组应用RFQ-PCR方法检测了6株肺癌细胞系中RRM 1,PTEN,ERCC 1,dCK,CDA 等基因的表达并检测了这些细胞对吉西他滨的IC50值,以探讨吉西他滨的耐药机制,为肿瘤患者的个体化选择化疗方案提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

吉西他滨为礼来公司产品,总RNA抽提试剂Trizol购于Promega公司,SYBRGreen I购自上海生工公司,其他试剂为进口及国产分析纯。洁净工作台、Icycler IQ TM 实时定量PCR仪为美国Bio-Rad公司生产,恒温培养箱为上海Heraeus公司产品。

1.2 细胞

人肺腺癌细胞GLC-82、NCI-H 460和A 549,人低转移和高转移的肺大细胞癌细胞95-C和95-D,人鳞状上皮癌细胞QG 56细胞均由解放军三〇七医院提供。

1.3 细胞培养

将肿瘤细胞接种于含青链霉素的DMEM培养液中,培养瓶大小为75cm2,置于37℃,CO2 体积分数为5%的培养箱中培养,48~72h换液或用0.2%胰酶消化,收集细胞。

1.4 RNA的提取

Trizo l法: 将细胞用冰预冷的PBS洗2遍加入1 mL Trizo,l混匀,室温放置5min;加入氯仿200μL,剧烈振荡15s; 室温平衡2~3min,4℃,12800×g离心15min,取上清液用等量异丙醇沉淀,室温平衡10min,4℃,12800×g离心15min弃上清液,沉淀用75%乙醇洗涤,干燥后用无RNA 酶水20μL溶解,紫外分光光度计进行RNA纯度及浓度的检测(D260 = 1 ,约为质量浓度40μg /mL RNA) ,经检测所有样品的RNA D260 /D280约为1.9~2.1。

1.5 cDNA的合成

按照反转录试剂盒提供的说明书,具体步骤如下: 取总RNA各4μL,加入1μLdNTP混合液(10mmol/L) ,1μ LOligo(dT)12~18(质量浓度0.5μg/L),加无核糖核酸酶水补充至10LL,混匀后于65℃温育5min,立即置冰浴中冷却1min,再加入2μL 10×RT Buffer,1μL RNaseinhib ito r(1u/μL),2μL DTT(0.1mol/L),4μL25mmol/LMgCl2,混匀并置42℃温育2min后,加入1μLSuperScript Ⅱ反转录酶(50u/μL)继续温育1 h,然后再于70℃ ,15min灭活反转录酶,再加入1μLRnaseH于37℃消化20min后-20℃保存备用。

1.6 MTT法检测吉西他滨对肿瘤细胞系的细胞毒作用

将处于对数生长期贴壁生长的肿瘤细胞制成悬液,将其接种于96孔板中,每孔细胞数5×103个/100μL,实验组分别加入吉西他滨(用0.9%的氯化钠溶液配制) ,设4个浓度分别为16.7、33.4、83.6和166mmol/L; 对照组用培养液替代抗癌药;空白组仅加入不含细胞的培养液,每组设3个复孔,37℃,CO2 体积分数为50%的培养箱培养72 h后,各孔加入质量浓度为5mg/mL的MTT,总体积为200μL。继续培养4 h,去上清液,最后加入DMSO,振荡10min,用酶标仪检测吸光度D 值(波长=570nm)。计算药物对各肿瘤细胞的抑制率(IR),IR=(1-用药组D值/对照组D值)×100%,并计算IC50值。

1.7 实时荧光定量PCR进行基因表达分析

每株细胞cDNA 均同时采用RFQ-PCR的方法检测β-actin,RRM1,PTEN,ERCC1,dCK 和CDA基因的表达情况,引物序列见表1。同一份标本各种基因的检测在不同的管中进行,每份标本各种基因的表达量均用其对应的β-actin 基因的量进行校正。目的基因的拷贝数计算公式: 目的基因拷贝数2-△CT=2-(△CT目的基因-△CT内参基因)

表1 实时荧光定量PCR检测所需的引物序列 Table 1 Primer sequences of five genes and β-actin internal control gene forRFQ-PCR detection
1.8 统计学分析

实验重复3次, 数据值均以?± s表示, 条件SAS 8. 2软件行Spearman秩行相关关系分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 模板的质量考核

采用β-actin作内对照,以校正样品在RNA提取及反转录过程的误差。实时荧光定量PCR检测cDNA中β-actin表达,每份标本均呈阳性反应,多数Ct值在18~22之间,最小为15.9,最大为22,说明标本cDNA质量符合要求。

2.2 6株肺癌细胞系中5种基因的表达情况

以6株细胞的cDNA 为模板同时检测RRM 1,PTEN,ERCC 1,dCKCDA 基因的表达情况。每份模板中各种基因的表达量均用其对应的β-actin 基因的量进行校正。可根据定量PCR中熔解曲线的Tm值区分各个基因的表达情况。RRM 1,PTEN,ERCC 1,dCKCDA 5种基因的熔解曲线Tm值分别为87℃,87℃,85℃,92℃和92℃,β-actin内参基因的熔解曲线Tm值为88℃(图1A)。基因的拷贝数的计算参照方法见1.7。5种基因Tm值的获得参见NC I-H460细胞(图1B)和A549细胞(图1C)。经过Spearman 秩相关分析表明r=0.821(RRM 1对PTEN)和0.951(RRM1对ERCC1)说明RRM 1基因的表达与PTENERCC 1的表达有相关性(表2)。

图1 6株细胞系中的β-actin熔解曲线和NCI-H460, A549 2株细胞中6个基因的熔解曲线 A: Th em elt ing cu rres ofB-actin; B: NC I-H 460; C: A549 Fig.1 Them elting curves of β-actin in 6 cells line as well as theme lting curves of 6 genes in both NCI-H460 and A549 cell lines

表2 6株肺癌细胞中5种基因表达 Table 2 Five gene expressions in six lung cancer cells
2.3 将6株肺癌细胞系经吉西他滨处理

用MTT法检测各株细胞系对吉西他滨的细胞毒作用,IC50值如图2

图2 吉西他滨对6株肺癌细胞系的抑制作用 Fig.2 The inhibition of gemcitabine to six lung cancer ce ll lines

在上述6株肺癌细胞中肺鳞癌QG 56细胞的RRM1 mRNA表达最高质量浓度为(38.532±2.001)ng/μL,PTEN mRNA的表达量为(13.031±0.569)ng/μL,ERCC 1mRNA基因表达量为(12.93±0.001)ng/μL,QG 56细胞系对吉西他滨的IC50值最高,质量浓度为11814ng /μL,这说明在肿瘤细胞系中吉西他滨耐药与RRM 1,PTEN,ERCC 1高表达相关,而与dCK,CDA基因的关系有待进一步研究。

3 讨 论

RRM 1基因是RNA合成的前体,参与核糖核苷酸还原成脱氧核糖核酸的过程[3, 4],是唯一催化核糖核苷酸转化为脱氧核糖核苷酸的酶。体外研究表明,吉西他滨的耐药与RRM 1基因的表达增高有关,表达高的患者对吉西他滨耐药。RRM 1基因诱导的磷酸化和FAK激酶的磷酸化需要PTEN基因的参与。RRM 1基因是PTEN的上游分子,通过增加PTEN的表达从而在细胞运动增殖中起重要作用[5, 6] 。脱氧胞嘧啶核苷酸磷酸化激酶(deoxycytide kinase ,dCK)是吉西他滨细胞毒作用的限速步骤,因此吉西他滨抗药就会导致dCK的减少。脱氧胞嘧啶核苷脱氨酶CDA,是通过不可逆的脱氨基作用灭活吉西他滨和其代谢物,它是体内灭活吉西他滨的重要酶[7]

吉西他滨和铂类药物具有协同抗肿瘤作用。顺铂导致的DNA损伤主要通过NER(nucleotide exc-ision repair,NER)途径修复,而切除修复交叉互补基因1(ERCC 1)在NER途径中起着关键作用。ERCC 1是NER的重要组份,已有很多文献报道了ERCC 1表达水平与铂类药物的敏感性密切相关,其表达水平可以当成铂类药物化疗效果的独立预测指标[8, 9]

本研究中主要通过RFQ-PCR技术中相对定量的方法检测了6株肺癌细胞中RRM 1、PTENdCKCDAm RNA等4种吉西他滨抗药相关基因的表达情况及铂类抗药基因ERCC 1的表达情况。发现上述6株肺癌细胞中RRM 1同PTEN和ERCC1基因的表达有相关性,相关系数分别为r=0.821和0.951,其中肺鳞癌QG 56细胞系中表达RRM 1基因量最高为(38.532±2.001)ng /μL,PTEN mRNA基因为(13.031±0. 569) ng/μL,ERCC 1基因为(12.935±0.001)ng /μL,QG 56细胞系对吉西他滨的IC50值的质量浓度为11814ng/μL,是6株细胞系中最高的。即QG 56细胞株中RRM 1,PTENERCC 1基因表达量明显高于其他肺癌细胞株,同时它对吉西他滨的IC50值最高,说明其对吉西他滨最不敏感,最耐药。在IC50值最高的QG 56细胞系中,dCK mRNA表达的减少和CDA mRNA的增加趋势不明显,dCK mRNA,CDAmRNA在各株细胞系中表达量与IC50值无明显关系,这两个基因的表达与吉西他滨耐药关系有待进一步研究。

通过检测肺癌细胞中5种吉西他滨耐药相关基因的表达情况及对吉西他滨的耐药情况,结果初步表明吉西他滨的耐药同RRM 1,PTENERCC 1基因的高表达有关。据此推断对切除的肺癌组织进行上述基因的检测可以指导肺癌患者的术后辅助化疗及对不能完全切除的肺癌患者的后续解救化疗方案选择提供一定的依据,此外与肿瘤细胞原代培养进行药敏试验相比,进行基因检测简易可行。

吉西他滨耐药是个复杂的过程,有多种基因参与。作者希望通过研究肺癌细胞系中各种基因表达与吉西他滨的细胞毒性之间的相关性进而探讨吉西他滨的耐药机制,可为肺癌患者的个体化用药提供理论依据。

参考文献
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