肿瘤  2011, Vol.31 Issue (7): 627-632   PDF    
EB病毒潜伏膜蛋白1介导的上皮-间质转化增强鼻咽癌的转移潜能
李 蓉1, 敬 敏2, 黎小兵1, 朱少平1, 黄培春1     
1. 广东医学院病理生理学教研室,湛江 524023;
2. 广东医学院病理学教研室,湛江 524023
[摘要]    目的:探讨EB病毒潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)和p38在鼻咽癌上皮-间质转化(epithelial -mesenchymal transition,EMT)中的调控作用,分析其介导的EMT与肿瘤转移的关系。方法:采用免疫组织/细胞化学法、RT-PCR和蛋白质印迹法等检测鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞中E-cadherin、vimentin、LMP1和p38的表达,Transwell实验检测鼻咽癌细胞的侵袭和运动能力。结果:E-cadherin在鼻咽癌和鼻咽癌颈部转移淋巴结组织中的阳性表达率有降低趋势(P<0.01),而vimentin和LMP1的阳性表达率有升高趋势(P<0.001),p38的阳性表达率差异则无统计学意义(P>0.05)。鼻咽癌组织中LMP1与E-cadherin的表达呈负相关(P<0.05);鼻咽癌颈部转移淋巴结组织中LMP1与E-cadherin的表达无相关性(P>0.05),而与vimentin的表达呈正相关(P<0.05)。E-cadherin mRNA和蛋白在CNE1-GL和CNE2Z细胞中的表达减弱,而vimentin mRNA和蛋白的表达增强。LMP1蛋白在CNE1-GL和CNE2Z细胞中高表达,p38蛋白则在CNE1-GL中高表达。Transwell实验证明,LMP1能够促进鼻咽癌细胞的运动和侵袭能力(P<0.001)。结论:LMP1可诱导鼻咽癌EMT,增强鼻咽癌的转移潜能。
[关键词]     鼻咽肿瘤    EB病毒潜伏膜蛋白1    p38    上皮-间质转化    转移    
Epstein-Barr virus-latent membrane protein 1-mediated epithelial-mesenchymal transition enhances the metastatic potential of nasopharyngeal carcinoma
LI Rong1, JING Min2, LI Xiao-bing1, ZHU Shao-ping1, HUANG Pei-chun1     
1. Department of Pathophysiology, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China;
2. Department of Pathology, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China
[Abstract]    Objective: To investigate the effects of Epstein-Barr virus-latent membrane protein 1 (LMP1) and p38 mediating epithelial-mesenchymal transition of nasopharyngeal carcinoma (NPC), and to elucidate its relationship with tumor metastasis. Methods: The expression levels of E-cadherin, vimentin, LMP1 and p38 in NPC tissues and cell lines were detected by immunohistochemistry, immunocytochemistry, RT-PCR and Western blotting. The invasion and migration abilities of NPC cell lines were examined by Transwell assay. Results: The positive expression rates of E-cadherin in different NPC tissues and lymph node metastases were decreased (P<0.01), whereas the positive expression rates of vimentin and LMP1 were increased(P<0.001). The difference in the positive expression rate of p38 was not statistically significant (P>0.05).The expression of LMP1 was negatively associated with the expression of E-cadherin in NPC tissues (P<0.05). In cervical lymph node metastasis, the expression of LMP1, which had no association with the expression of E-cadherin (P>0.05), was associated with the expression of vimentin (P<0.05). The expressions of E-cadherin mRNA and protein were suppressed in CNE1-GL and CNE2Z cells, whereas the expressions of vimentin mRNA and protein were increased. The expression level of LMP1 protein was high in CNE1-GL and CNE2Z cells, and the expression level of p38 protein was high in CNE1-GL cells. Transwell assay showed that LMP1 could promote the migration and invasion abilities of NPC cells (P<0.001). Conclusion: LMP1 can induce EMT and enhance the metastatic potential of nasopharyngeal carcinoma.
[Key words]     Nasopharyngeal neoplasms    Epstein-Barr virus-latent membrane protein 1    p38    epithelial-mesenchymal transition    Metastasis    

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)与鼻咽癌的转移相关[1]。EBV潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)是EBV编码的一种6次跨膜分子,能活化多种细胞内信号途径,促使细胞发生恶性转化,并赋予肿瘤细胞更强的转移能力。本课题组的既往研究发现,LMP1可通过Ezrin促进鼻咽癌细胞转移[2, 3],但尚未明确其确切机制。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是胚胎发育过程中的生理现象。近年来发现,部分上皮细胞来源的恶性肿瘤在其发生和发展过程中会出现“返祖现象”,EMT可被重新“激活”,从而显著增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力[4, 5]。EMT在肿瘤侵袭和转移中的重要作用正日益受到关注,但目前对其调控机制的认识仍十分有限。同时,由于各种肿瘤所处的微环境不同,调控EMT的机制也不尽相同。因此,本研究应用免疫组织/细胞化学法和蛋白质印迹法检测上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、LMP1和p38在鼻咽癌组织及细胞中的表达,RT-PCR检测鼻咽癌细胞中E-cadherin和vimentin mRNA的表达,Transwell小室检测鼻咽癌细胞的运动和侵袭能力,旨在探讨LMP1和p38在鼻咽癌EMT中的调控作用,分析其介导的EMT与鼻咽癌细胞侵袭和转移的关系。

1 材料与方法 1.1 组织标本

收集广东医学院附属医院病理科2007—2009年的存档资料,包括经2名病理科主任医师确诊的鼻咽黏膜慢性炎性组织18例、鼻咽分化型非角化性鳞癌组织28例和鼻咽癌颈部转移淋巴结组织13例。所有病例的资料完整,诊断前未接受过抗肿瘤治疗。所有标本均经10%甲醛溶液固定,常规脱水、透明、浸蜡、包埋,切成4 μm厚的连续切片。

1.2 鼻咽癌细胞株

EBV阴性的人鼻咽低分化癌细胞株CNE2Z、EBV阴性的人鼻咽高分化鳞癌细胞株CNE1以及稳定表达EBV-LMP1的CNE1细胞株CNE1-GL[6]均由广东医学院病理学教研室提供。

1.3 主要试剂

RT-PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司;E-cadherin和vimentin mRNA的PCR引物由生工生物(上海)有限公司合成;兔抗人p38多克隆抗体和鼠抗人E-cadherin单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司,鼠抗人vimentin单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司,鼠抗人LMP1单克隆抗体购自丹麦Dako公司;SP检测试剂盒购自福建迈新生物技术开发有限公司;纤连蛋白(fibronectin,FN)和重组Matrigel购自美国BD公司;Transwell小室(直径6.5 mm,孔径8.0 μm)购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.4 细胞培养

用含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液(CNE1-GL细胞培养液另含0.5 μg/mL嘌呤霉素),于37℃、CO2体积分数为5%的饱和湿度条件下培养CNE2Z、CNE1和CNE1-GL细胞。

1.5 免疫组织化学法检测鼻咽组织E-cadherin、vimentin、LMP1和p38蛋白的表达

采用免疫组织化学SP法。用二甲苯和梯度乙醇溶液对石蜡切片进行脱蜡水化;置于3% H2O2溶液中,室温(15~28 ℃)孵育10~15 min,以消除内源性过氧化物酶的影响;然后在PBS中浸洗5 min,采用抗原热修复法进行抗原修复;滴加封闭血清,37 ℃孵育10 min;甩干后,分别滴加一抗鼠抗人E-cadherin(1:50)、鼠抗人vimentin(1:100)、鼠抗人LMP1(1:50)和兔抗人p38(1:50),4 ℃孵育过夜;二抗采用通用型超敏试剂盒,按说明书进行操作。DAB显色,室温显色3 min后,用自来水充分冲洗,苏木精对比染色,盐酸乙醇溶液分色;置于60 ℃烤箱中烘干30 min,用中性树脂封片。

采用双盲法,通过阅片判定结果,每张切片至少选取5个以上典型的高倍视野,每个高倍视野不少于500个细胞。细胞膜或细胞质无着色为阴性细胞,出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。阳性细胞百分比评分标准:全部为阴性细胞,计0分;阳性细胞百分比≤10%,计1分;阳性细胞百分比为11%~50%,计2分;阳性细胞百分比为51%~75%,计3分;阳性细胞百分比>75%,计4分。染色强度评分标准:无染色,计0分;淡黄色,计1分;棕黄色,计2分;深棕色,计3分。结合阳性细胞百分比和染色强度评分综合判定免疫组织化学结果:2项评分乘积为0~1分为阳性(-);2~3分为阳性(+);≥4分为强阳性(++)。

1.6 免疫细胞化学法检测鼻咽癌细胞LMP1的表达

将CNE2Z、CNE1和CNE1-GL这3种鼻咽癌细胞株铺在6孔板中的盖玻片上,覆盖面积达85%,用预冷的甲醇:丙酮(体积比为1:1)溶液固定,PBS洗涤,后续步骤和结果判断同1.5节。

1.7 重组基膜侵袭和趋化运动实验检测鼻咽癌细胞的侵袭和运动能力

在Transwell小室膜内表面涂抹基膜成分Matrigel 10 μg(50 μL),在超净台中通风过夜使之干燥,形成人工重组基底膜。在24孔培养板中加入含10 μg/mL FN的RPMI 1640培养液600 μL。收集CNE2Z、CNE1和CNE1-GL对数生长期细胞,用含1% BSA的RPMI 1640培养液重悬细胞,并调整细胞密度均为1×109个/L。将Transwell小室浸于24孔板中的条件培养液中,每一个小室加入细胞悬液100 μL,置于培养箱内培养24 h后,取出Transwell小室;用甲醇溶液固定滤膜,结晶紫染色,用棉签小心擦去未穿膜的细胞;干燥后,中性树胶封片,于400倍光学显微镜下计数穿过滤膜的细胞数。对每一个滤膜随机选取上下左右中共5个不同视野进行细胞计数,每组平行设3个滤膜。趋化运动实验与重组基膜侵袭实验步骤相比,只是前者的PVPF滤膜上不需铺盖Matrigel,其余均相同。

1.8 RT-PCR检测鼻咽癌细胞E-cadherin和vimentin mRNA的表达

分别收集4×105个CNE2Z、CNE1和CNE1-GL细胞,按TRIzol一步法试剂盒说明书进行操作,提取细胞总RNA。按一步法RT-PCR试剂盒说明书进行反转录和目的片段扩增。E-cadherin上游引物为5’-AGTGACGAATGTGGTACCTTTTGA-3’,下游引物为5’-TGAAGGGAGATGTTTGGG-GAGGAAGGTC-3’,扩增产物大小为507 bp;vimentin上游引物序列为5’-TGGCACGTCTT-GACCTTGAA-3’,下游引物序列为5’-GGTCAT-CGTGATGCTGAGAA-3’,扩增产物大小为750 bp;GAPDH上游引物序列为5’-ACGGATT-TGGTCGTATTGGG-3’,下游引物序列为5’-TG-ATTTTGGAGGGATCTCGC-3’,扩增产物大小为231 bp。扩增条件:预变性94 ℃ 3 min;变性94 ℃ 45 s、退火56 ℃ 1 min、延伸72 ℃ 1 min,共31个循环;最后72 ℃延伸7 min。取扩增产物5 μL,进行2.0%琼脂糖凝胶(内含溴化乙啶染料)电泳检测,紫外灯下观察,并用凝胶成像系统拍照。

1.9 蛋白质印迹法检测鼻咽癌细胞LMP1、p38、E-cadherin和vimentin的表达

分别取1×106个CNE2Z、CNE1和CNE1-GL细胞,用细胞裂解液裂解30 min,收集蛋白裂解液,15 000×g离心10 min,取上清液。BCA法测定蛋白浓度,取100 μg蛋白和5×上样缓冲液混匀,沸水变性5 min,行SDS-PAGE电泳分离蛋白。采用湿法电转移至聚偏氟乙烯膜,用5%脱脂奶粉室温封闭1 h,TBST缓冲液清洗3次(5 min/次);分别加入相应一抗鼠抗人LMP1(1:100)、兔抗人p38(1:400)、鼠抗人E-cadherin(1:400)和鼠抗人vimentin(1:400),4 ℃孵育过夜,TBST液清洗3次;与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG室温孵育2 h,TBST液清洗3次;电化学发光检测,X线胶片曝光,扫描。将β-actin(1:2 000)作为内参照。

1.10 统计学方法

应用SPSS 13.0软件处理数据。计量资料以 ± s表示。根据具体数据,多组之间的比较采用单因素方差分析或χ2检验,相关性分析采用Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 免疫组织化学法检测E-cadherin、vimentin、LMP1和p38在鼻咽黏膜慢性炎性组织、鼻咽癌和鼻咽癌颈部转移淋巴结组织中的阳性表达

E-cadherin在鼻咽黏膜慢性炎性组织、鼻咽癌和鼻咽癌颈部转移淋巴结组织中的阳性表达率呈依次降低趋势,鼻咽黏膜慢性炎性组织与鼻咽癌和鼻咽癌颈部转移淋巴结组织的E-cadherin阳性表达率差异有统计学意义(χ2=9.874,P<0.01);vimentin和LMP1在鼻咽黏膜慢性炎性组织中的阳性表达率与鼻咽癌和鼻咽癌颈部转移淋巴结组织的差异均有统计学意义(χ2=16.399,P<0.001;χ2=19.871,P<0.001);p38在鼻咽癌和鼻咽癌颈部转移淋巴结组织中的阳性表达率与鼻咽黏膜慢性炎性组织相比,差异无统计学意义(P>0.05),见表1图1

表1 免疫组织化学法检测E-cadherin、vimentin、LMP1和p38蛋白在鼻咽黏膜慢性炎性组织、鼻咽癌和鼻咽癌颈部转移淋巴结组织中的阳性表达 Table 1 The positive expressions of E-cadherin, vimentin, LMP1 and p38 proteins in chronic nasopharyngitis, nasopharyngeal carcinoma and its metastatic cervical lymph node tissues determined by immunohistochemistry
图1 免疫组织化学SP法检测E-cadherin、vimentin、LMP1和p38蛋白在鼻咽癌组织中的阳性表达 Fig.1 The positive expressions of E-cadherin (A, ×100), vimentin (B, ×200), LMP1 (C, ×100) and p38 (D, ×200) proteins in nasopharyngeal carcinoma tissues determined by SP immunohistochemistry. If the E-cadherin, vimentin, LMP1 and p38 proteins are present in the cytoplasm and plasma membrane, they will stain yellow-brown.
2.2 鼻咽癌和鼻咽癌颈部转移淋巴结组织中LMP1与E-cadherin和vimentin表达的相关性分析

Spearman相关分析显示,鼻咽癌组织中LMP1与E-cadherin的表达呈负相关(r2=-0.406,P<0.05),LMP1与vimentin的表达呈正相关(r2=0.420,P<0.05);鼻咽癌颈部转移淋巴结组织中,LMP1与E-cadherin的表达无相关性(r2=-0.093,P<0.05),LMP1与vimentin的表达呈正相关(r2=0.657,P<0.05),见表2

表2 鼻咽癌和鼻咽癌颈部转移淋巴结组织中LMP1与E-cadherin和vimentin表达的相关性 Table 2 Association between E-cadherin expression and vimentin/LMP1 expression in nasopharyngeal carcinoma and its metastatic cervical lymph node
2.3 鼻咽癌细胞的侵袭和运动能力

重组基底膜侵袭实验中,每个视野穿过滤膜的CNE1、CNE1-GL和CNE2Z细胞平均数分别为(21±7)、(103±15)和(118±25)个,组间差异有统计学意义(P<0.001,图2AC)。趋化运动实验中,每个视野穿过滤膜的CNE1、CNE1-GL和CNE2Z细胞平均数分别为(31±6)、(186±17)和(136±18)个,组间差异有统计学意义(P<0.001,图2DF)。

图2 Transwell小室检测CNE1、CNE1-GL和CNE2Z细胞的侵袭和运动能力(×400) Fig.2 The invasion (A-C) and migration (D-F) abilities of nasopharyngeal carcinoma CNE1 (A and D), CNE1-GL (B and E) and CNE2Z cells (C and F) detected by Transwell assay (×400). There were significant differences in the invasion and migration abilities among these three cells.
2.4 RT-PCR检测E-cadherin和vimentin mRNA在鼻咽癌细胞中的表达

E-cadherin mRNA在CNE1-GL细胞中的表达明显低于CNE1和CNE2Z细胞,而vimentin mRNA在CNE1-GL细胞中的表达则明显高于CNE1细胞(图3)。

图3 E-cadherin和vimentin RNA在CNE1、CNE1-GL和CNE2Z鼻咽癌细胞中的表达 Fig.3 Expressions of E-cadherin (A) and vimentin (B) mRNAs in the nasopharyngeal carcinoma CNE1, CNE1-GL and CNE2Z cells detected by RT-PCR. The expression of E-cadherin mRNA was obviously lower in CNE1-GL cells than those in CNE1 and CNE2Z cells (A), but the expression of vimentin mRNA was obviously higher in CNE1-GL cells than that in CNE1 cells (B).
2.5 免疫细胞化学法检测LMP1蛋白在鼻咽癌细胞中的表达

LMP1蛋白表达于细胞膜和细胞质,呈棕黄色颗粒状分布。检测结果显示,CNE1细胞未见明显染色;CNE1-GL和CNE2Z细胞均为阳性染色。LMP1蛋白在CNE1、CNE1-GL和CNE2Z细胞中的阳性表达率分别为0%、(98.2±0.9)%和(86.3±1.9)%,CNE1细胞与CNE1-GL和CNE2Z细胞之间的差异有统计学意义(P<0.001,图4)。

图4 免疫细胞化学SP法检测CNE1、CNE1-GL和CNE2Z细胞中LMP1蛋白的表达(×400) Fig.4 Expression of LMP1 protein in CNE1 (A), CNE1-GL (B) and CNE2Z (C) cells detected by SP immunocytochemistry (×400). The expression of LMP1 protein was absent in CNE1 cells (A), but the positive expression rates of LMP1 protein in CNE1-GL (B) and CNE2Z (C) cells were both high.
2.6 蛋白质印迹法检测E-cadherin、vimentin、LMP1和p38在鼻咽癌细胞中的表达

CNE1-GL和CNE2Z细胞中E-cadherin的表达减弱,vimentin表达增强,而p38的表达水平在CNE1-GL中较高(图5)。

图5 蛋白质印迹法检测E-cadherin、vimentin、LMP1和p38在鼻咽癌细胞中的表达 Fig.5 Expressions of E-cadherin, vimentin, LMP1 and p38 in CNE1, CNE1-GL and CNE2Z cells detected by Western blotting. In CNE1-GL and CNE2Z cells, the expression of E-cadherin was low but the expression of vimentin was high. The expression of p38 was higher in CNE1-GL cells than those in CNE2Z and CNE1 cells.
3 讨 论

EMT最初被用来描述胚胎发育阶段间质细胞从上皮细胞演变而来的现象,中胚层的形成以及神经嵴细胞的迁移和分化均与EMT有关。近年来认为EMT还参与了恶性肿瘤的发生和发展。鼻咽癌是一种EBV相关肿瘤,容易发生早期转移。LMP1是EBV编码的蛋白,尽管目前在LMP1诱导肿瘤细胞转移的机制研究方面已取得了很大的进展[7, 8, 9],但有关EMT是否参与了鼻咽癌的发生和发展以及LMP1是否参与了EMT调控的报道仍较少。

本研究采用免疫组织/细胞化学法、RT-PCR和蛋白质印迹法等方法检测了鼻咽癌组织或细胞中E-cadherin、vimentin和LMP1的表达,结果表明上皮标志物E-cadherin在鼻咽癌和鼻咽癌颈部转移淋巴结组织中的表达呈下降趋势,而间叶标志物vimentin和LMP1的表达则呈升高趋势。在人低分化鼻咽癌CNE2Z细胞中,E-cadherin mRNA和蛋白的表达均减弱,反之vimentin mRNA和蛋白的表达却增强。由此说明,EMT可能参与了鼻咽癌的发生和发展。相关性分析结果显示,鼻咽癌组织中LMP1与E-cadherin的表达呈负相关(P<0.05),而与vimentin的表达呈正相关(P<0.05);鼻咽癌颈部转移淋巴结组织中,LMP1与E-cadherin的表达无相关性,而与vimentin的表达呈正相关(P<0.05)。Transwell实验证明,CNE1-GL和CNE2Z细胞的穿膜细胞数明显多于CNE1细胞,表明LMP1可能参与了EMT的调控,LMP1介导的EMT能够增加鼻咽癌的转移潜能。这一结果与Horikawa等[10]报道的LMP1可诱导twsit和EMT,从而有助于鼻咽癌转移的结果一致。

一些在胚胎发育阶段调控上皮-间质转型的关键转录因子,诸如snail、slug和twsit等,在恶性肿瘤中被重新活化,从而参与了恶性肿瘤的发生和发展[11, 12]。p38可调节E-cadherin蛋白的表达,并独立于纤维原细胞生长因子信号途径和snail的转录调节[13]。目前对于p38是否是EMT的调控因子而参与了鼻咽癌的发生和进展的研究还较少。本研究结果显示,p38在鼻咽癌和鼻咽癌颈部转移淋巴结组织中的阳性表达率与鼻咽黏膜慢性炎性组织相比,差异无统计学意义(P>0.05),不过p38在CNE1-GL细胞中高表达。关于p38的高表达是否与LMP1有关,值得开展进一步的研究。

总之,目前认为LMP1参与了EMT的调控,LMP1介导的EMT可增强鼻咽癌的转移潜能。至于p38是否参与了鼻咽癌的EMT,尚有待进一步研究。

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