肿瘤  2016, Vol. 36 Issue (12): 1307-1311   PDF    
藤龙补中汤促人结肠癌RKO细胞衰老及其可能的作用机制
胡兵1,2, 安红梅3, 郑佳露1,2, 闫霞1,2, 黄晓伟1,2     
1. 上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科, 上海 200032 ;
2. 上海市中医药研究院中医肿瘤研究所, 上海 200032 ;
3. 上海中医药大学附属龙华医院科技处, 上海 200032
[摘要] 目的: 观察藤龙补中汤对人结肠癌RKO细胞衰老及其调控基因表达的影响。 方法: 藤龙补中汤处理人结肠癌RKO 细胞后,应用衰老相关β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老情况,PCR 芯片检测细胞衰老调控基因转录,蛋白质印迹法检测细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂1A(cyclin-dependent kinase inhibitor1A,CDKN1A)/ 细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂2A(cyclin-dependent kinaseinhibitor 2A,CDKN2A)-视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,RB)-E2F 转录因子1(E2F transcription factor 1,E2F1)信号通路中相关蛋白的表达。 结果: 藤龙补中汤可促结肠癌RKO 细胞衰老(P<0.01),CDKN1A 和CDKN2A 转录和蛋白表达水平均上调(P 值均<0.01),E2F1 下游基因细胞周期蛋白A2(cyclin A2,CCNA2)、细胞周期蛋白E1(cyclin E1,CCNE1)和细胞周期蛋白依赖激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2)转录和蛋白表达水平均下调(P 值均<0.05),RB1 蛋白的磷酸化被抑制(P<0.01)。 结论: 藤龙补中汤可促进人结肠癌RKO 细胞衰老,可能与调控CDKN1A/CDKN2A-RB-E2F1 信号通路相关。
[关键词]     结肠肿瘤     药物疗法     抗肿瘤药     细胞衰老     基因表达    
Teng-Long-Bu-Zhong-Tang decoction promotes cell senescence of human colon carcinoma RKO cells and its possible mechanism
HU Bing1,2, AN Hongmei3, ZHENG Jialu1,2, YAN Xia1,2, HUANG Xiaowei1,2     
1. Department of Oncology, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, S hanghai 200032, China ;
2. Institute of Traditional Chinese Medicine in Oncology, Shanghai Academy of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China ;
3. Department of Science & Technology, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China
[Abstract] Objective: To observe the effects of Teng-Long-Bu-Zhong-Tang (TLBZT) decoction on cell senescence and the expressions of the related regulatory genes in human colon carcinoma RKO cells. Methods: After RKO cells were treated with TLBZT decoction, the cell senescence was identified by senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) staining, the transcription of cell senescence regulatory genes was detected by PCR array, and the expressions of proteins in cyclindependent kinase inhibitor 1A (CDKN1A)/cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (CDKN2A)-retinoblastoma protein (RB)-E2F transcription factor 1 (E2F1) signal pathway were detected by Western blotting. Results: TLBZT decoction promoted cell senescence of RKO cells (P<0.01). The transcription and expression of CDKN1A and CNKN2A were up-regulated (all P<0.01) in RKO cells after treatment with TLBZT decoction, the transcription and expression of E2F1-targeted genes including cyclin A2 (CCNA2), cyclin E1 (CCNE1) and cyclindependent kinase 2 (CDK2) were down-regulated (all P<0.05), and the phosphorylation of RB1 was inhibited (P<0.01). Conclusion: TLBZT decoction promots cell senescence in RKO cells, and this effect may be related to CDKN1A/CDKN2A-RB-E2F1 signal pathway.
[Key words]     Colon neoplasms     Drug therapy     Antineoplastic agents     Cell aging     Gene expression    

结直肠癌是常见的恶性肿瘤,晚期结直肠癌的临床疗效欠佳,而中医药在结直肠癌的治疗中发挥了积极的作用[1-2]。藤龙补中汤(专利号:ZL200910197565.2)是上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科的临床验方。在细胞与动物模型中,藤龙补中汤可以促结肠癌细胞衰老;在临床治疗中,藤龙补中汤可以改善结直肠癌患者临床证候,提高患者的生活质量,改善机体的免疫功能,抑制结直肠癌生长[3-6]。本研究探讨了藤龙补中汤对人结肠癌RKO细胞的促衰老作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

DMEM培养液、胎牛血清和胰蛋白酶均购自美国Gibco公司,BCA蛋白浓度检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。鼠抗人E2F转录因子1(E2F transcription factor 1,E2F1)和视网膜母细胞瘤蛋白1(retinoblastoma protein 1,RB1)单克隆抗体购自美国BD Biosciences公司,兔抗人细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A,CDKN2A)多克隆抗体购自美国Proteintech公司,兔抗人细胞周期蛋白E1(cyclin E1,CCNE1)、细胞周期蛋白A2(cyclin A2,CCNA2)、细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A,CDKN1A)、磷酸化RB1(phospho-RB1,p-RB1)和β-actin多克隆抗体均购自美国Bioworld公司,兔抗人细胞周期蛋白依赖激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2)单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司,荧光标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG购自美国KPL公司。其他试剂均为中国产分析纯试剂。

1.2 藤龙补中汤提取物的制备

藤龙补中汤由藤梨根30 g、龙葵15 g、白术9 g、薏苡仁30 g和槲寄生15 g等组成。按参考文献[3]的方法煎制和浓缩藤龙补中汤,PBS调整藤龙补中汤的质量浓度为500 mg/mL,分别用装有0.45 μm和0.22 μm滤膜的滤器过滤除菌,分装后置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.3 细胞及细胞培养

人结肠癌RKO细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。RKO细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液,置于37 ℃、CO2体积分数为5%的饱和湿度培养箱中培养。

1.4 衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal)染色法[7-8]检测藤龙补中汤对结肠癌RKO细胞衰老的影响

取对数生长期的RKO细胞接种于6孔培养板中(3×105个/孔),细胞接种后第2天更换新鲜培养液,并加入藤龙补中汤提取物(使其终质量浓度为500 μg/mL)或PBS(对照组),每组重复3个孔。藤龙补中汤提取物处理24 h后弃培养液,PBS洗涤1次,用2%甲醛溶液和0.2%戊二醛溶液室温固定细胞15 min;PBS洗涤3次,加入SA-β-gal反应液(含1 mg/mL X-gal、pH 6.0的40 mmol/L柠檬酸钠、5 mmol/L亚铁氰化钾、5 mmol/L铁氰化钾、150 mmol/L氯化钠和2 mmol/L氯化镁),37 ℃反应过夜;在光学显微镜下(放大倍数为200倍)观察并计数细胞核蓝染的衰老细胞数,每组观察3个视野。

1.5 PCR芯片检测藤龙补中汤对结肠癌RKO细胞衰老调控基因转录的影响

常规消化计数RKO细胞,接种于直径为10 cm的培养皿中(2×106个/皿),细胞接种第2天更换新鲜培养液,加入含终质量浓度为500 μg/mL的藤龙补中汤提取物或等体积PBS(对照组),每组设3个重复样本。收集藤龙补中汤提取物作用24 h后的RKO细胞,送至上海康成生物工程有限公司,应用人细胞衰老PCR芯片(货号为PAHS-050Z,德国Qiagen公司产品)检测细胞衰老调控基因的转录情况。人细胞衰老PCR芯片是96孔板规格的实时荧光定量PCR体系,孔内预置84个细胞衰老调控基因、5个内参照基因、1个基因组DNA污染对照、3个反转录阴性对照和3个阳性对照基因引物。以2-ΔΔCt值表示目的基因的相对表达水平。

1.6 蛋白质印迹法检测藤龙补中汤对结肠癌RKO细胞衰老调控相关蛋白表达的影响

按1.5节的方法用藤龙补中汤提取物或等体积PBS(对照组)处理RKO细胞24 h后收集细胞,用细胞裂解液(含pH 8.0的50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、1% NP-40及1×蛋白酶抑制剂Cocktail)提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白质浓度。取蛋白质20 μg/孔进行8%(检测RB1和p-RB1)或10%(检测CDKN2A、CCNE1、CCNA2和CDKN1A)SDS-PAGE,将电泳分离后的蛋白质电转移至PVDF膜上;用含5%脱脂奶粉的封闭液在室温下封闭2 h,分别加入鼠抗人E2F1和RB1单克隆抗体,兔抗人CDKN2A、CCNE1、CCNA2、CDKN1A、p-RB1、β-actin(内参照)多克隆抗体以及兔抗人CDK2单克隆抗体,抗体的体积稀释比例均为1∶1 000,4 ℃反应过夜;PBST洗涤3次,加入荧光标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG(体积稀释比例为1∶5 000),37 ℃反应1 h;PBST洗涤3次后,在红外荧光成像系统中扫描图像,应用Quantity One软件分析目的蛋白条带的灰度值,以目的蛋白条带灰度值与内参照蛋白条带灰度值之比表示目的蛋白的相对表达水平。

1.7 统计学方法

本研究中的各项实验均独立重复3次。应用SPSS 18.0软件对研究结果进行统计分析,计量资料以x ± s表示;数据服从正态分布,总体方差齐,则2组间的比较采用t检验,否则采用Wilcoxon秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 藤龙补中汤诱导RKO细胞衰老

终质量浓度为500 μg/mL的藤龙补中汤提取物处理RKO细胞24 h后,应用SA-β-gal染色法检测细胞的衰老情况。结果(图 1)显示,藤龙补中汤提取物处理组RKO细胞分布稀疏,有较多衰老细胞,蓝染的细胞呈现大而扁平的形态,衰老细胞数显著多于对照组(P<0.01)。

图 1 SA-β-gal染色法检测藤龙补中汤对结肠癌RKO细胞衰老的影响 Fig. 1 The effect of Teng-Long-Bu-Zhong-Tang (TLBZT) decoction on the cell senescence of colon carcinoma RKO cells was detected by senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal) staining (×200) . RKO cells treated with PBS were used as the control. **P<0.01,vs the control (n=3) .

2.2 藤龙补中汤调节细胞衰老调控基因的转录

终质量浓度为500 μg/mL的藤龙补中汤提取物处理RKO细胞24 h后,应用人细胞衰老PCR芯片检测细胞衰老调控基因的转录情况。结果(图 2A)显示,在PCR芯片上的84个细胞衰老调控基因中有5个差异转录基因,这些差异转录基因集中在CDKN1A/CDKN2A-RB-E2F1信号通路中。其中,CCNA2、CCNE1和CDK2转录水平降低,CDKN1A和CDKN2A 转录水平升高,与对照组比较差异均有统计学意义(P值均<0.05);而E2F1和RB1 转录水平无明显变化(P值均>0.05)。

图 2 PCR芯片(A)和蛋白质印迹法(B)检测藤龙补中汤对结肠癌RKO细胞衰老调控基因转录和蛋白表达的影响 Fig. 2 The effects of Teng-Long-Bu-Zhong-Tang (TLBZT) decoction on the transcription and expression of cell senescence regulatory genes in colon carcinoma RKO cells were detected by PCR array (A) and Western blotting (B),respectively. CCNA2: Cyclin A2; CCNE1: Cyclin E1; CDK2: Cyclin-dependent kinase 2; CDKN1A: Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A; CDKN2A: Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A; E2F1: E2F transcription factor 1; RB1: Retinoblastoma protein 1; p-RB1: phospho-RB1. RKO cells treated with PBS were used as the control. *P<0.05,**P<0.01,vs the control (n=3) .

2.3 藤龙补中汤调节细胞衰老调控蛋白的表达

基于PCR芯片的检测结果,应用蛋白质印迹法检测终质量浓度为500 μg/mL的藤龙补中汤提取物处理24 h后,RKO细胞中CDKN1A/CDKN2A-RB-E2F1信号通路相关蛋白的表达情况。结果(图 2B)显示,CCNA2、CCNE1和CDK2蛋白的表达水平低于对照组(P值均<0.01),CDKN1A和CDKN2A蛋白的表达水平高于对照组(P值均<0.01),RB1蛋白的磷酸化被抑制(P<0.01),而E2F1和RB1蛋白的表达水平无明显变化(P值均>0.05)。

3 讨论

结直肠癌是全球常见的恶性肿瘤之一,其发病率位居男性肿瘤的第3位及女性肿瘤的第2位,结直肠癌发病率在中国呈上升趋势[9-10]。中医药在结直肠癌治疗中发挥着积极的作用,中医药联合手术、化疗或中医药单独治疗中晚期结直肠癌已成为中国结直肠癌治疗的一大特色。中医药治疗结直肠癌可以改善患者的临床证候,提高患者的生活质量,改善免疫功能,并可在一定程度上抑制肿瘤生长及预防肿瘤的转移[1-2]。结直肠癌归属于中医的“肠覃”、“脏毒”、“积聚”和“肠癖”等范畴,毒聚、湿阻和脾虚是结直肠癌的基本病机。藤龙补中汤是上海中医药大学附属龙华医院肿瘤临床验方,方中的藤梨根和龙葵具有解毒利湿的作用,是主要的抗癌中药;白术和薏苡仁可健脾利湿;槲寄生则可协同抗癌并抗肿瘤新生血管的生成[8, 10-11]

细胞衰老是细胞不可逆地撤离细胞周期后进入的一种稳定状态,衰老的细胞不再增殖,呈现大而扁平的细胞形态,SA-β-gal染色呈阳性。细胞衰老是药物治疗肿瘤的重要作用机制,已成为肿瘤治疗研究的靶标[12]。既往研究显示,藤龙补中汤可以上调p21和p16的表达,抑制RB的磷酸化,阻滞细胞周期,促进结肠癌细胞的衰老[3-4]。本研究结果证实,藤龙补中汤促进结肠癌RKO细胞的衰老可能与上调CDKN1A和CDKN2A的表达有关。

CDKN1A/CDKN2A可以抑制cyclin/CDKs的活性,进而抑制RB的磷酸化。RB蛋白下游信号转导与E2F1有关,低磷酸化的RB与E2F转录因子结合,使E2F1不能激活细胞周期必需基因的表达,无法启动染色体复制以完成增殖活动,进而使细胞周期停滞于G0期,启动细胞衰老。E2F是重要的转录因子,E2F1靶基因包括CCNE1、CCNA2和CDK2等与细胞周期调控和DNA合成/复制相关的基因,抑制RB和E2F的活性可以促进肿瘤细胞的衰老[3, 13-16]。本研究结果显示,藤龙补中汤作用后,结肠癌RKO细胞中RB和E2F1的表达无明显变化,但RB的磷酸化水平降低,CCNE1、CCNA2和CDK2的表达降低,提示藤龙补中汤下调CCNE1、CCNA2和CDK2的表达可能与上调CDKN1A和CDKN2A的表达及抑制RB磷酸化有关。

综上所述,本研究结果显示藤龙补中汤可促结肠癌细胞衰老,这一作用可能与CDKN1A/CDKN2A-RB-E2F信号通路有关。

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