肿瘤  2017, Vol. 37 Issue (11): 1119-1127   PDF    
细胞周期蛋白依赖性激酶7基因沉默或敲除抑制卵巢癌细胞增殖及其机制探讨
彭慧昕1, 高维强1,2, 庄光磊1,3     
1. 上海交通大学医学院附属仁济医院, 癌基因及相关基因国家重点实验室, 临床干细胞研究中心, 上海 200127;
2. 上海交通大学生物医学工程学院 & Med-X研究院, 上海 200240;
3. 上海交通大学医学院附属仁济医院上海市妇科肿瘤重点实验室, 上海 200127
[摘要] 目的: 探讨细胞周期蛋白依赖性激酶7(cyclin-dependent kinase 7,CDK7)对卵巢癌细胞增殖的作用。方法: 应用特异性siRNA转染法沉默卵巢癌OVCA433、TOV-112D和IGROV1细胞中CDK7基因表达后,采用CCK-8法检测细胞增殖能力。应用成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)及其相关核酸内切酶9(CRISPR-associated endonuclease 9,Cas9)基因编辑系统敲除卵巢癌HEY、OVCA420、OVCA433和IGROV1细胞中的CDK7基因后,采用克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。用CDK7抑制剂THZ1处理卵巢癌TOV-112D、IGROV1、OVCA433、OVCAR8、OV90、SKOV3和COV413B细胞后,采用CCK-8法和克隆形成实验检测TOV-112D、IGROV1、OVCA433、OVCAR8和OV90细胞增殖和克隆形成能力,蛋白质印迹法检测IGROV1、OVCA433、SKOV3和COV413B细胞中CDK7蛋白表达水平和RNA聚合酶Ⅱ磷酸化水平。结果: 沉默或敲除CDK7基因后,卵巢癌细胞的增殖和克隆形成能力均明显减弱(P值均 < 0.05)。THZ1处理可抑制卵巢癌细胞的增殖和克隆形成,并下调CDK7蛋白表达和RNA聚合酶Ⅱ磷酸化(P值均 < 0.05)。结论: CDK7可能通过调控RNA聚合酶Ⅱ磷酸化,促进卵巢癌细胞的增殖。
[关键词]     卵巢肿瘤     细胞增殖     基因沉默     基因敲除技术     细胞周期蛋白质依赖性激酶类    
Cyclin-dependent kinase 7 gene silencing or knockout represses proliferation of ovarian cancer cells and the mechanism research
PENG Huixin1, GAO Weiqiang1,2, ZHUANG Guanglei1,3     
1. State Key Laboratory of Oncogenes and Related Genes, Clinical Stem Cell Research Center, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200127, China;
2. School of Biomedical Engineering & Med-X Research Institute, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China;
3. Shanghai Key Laboratory of Gynecologic Oncology, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200127, China
GRANTS: National Natural Science Foundation of China(No: 81672714)
[Abstract] Objective: To investigate the role of cyclin-dependent kinase 7 (CDK7) in the proliferation of ovarian cancer cells. Methods: The ovarian cancer cell lines OVCA433, TOV-112D and IGROV1 were transfected with specific siRNA to downregulate the expression of CDK7 gene, then the cell proliferation viability was detected by CCK-8 method. The CDK7 gene in ovarian cancer HEY, OVCA420, OVCA433 and IGROV1 cells was knocked out by clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated endonuclease 9 (Cas9) system, then the clone formation ability was detected by plate clone formation assay. The ovarian cancer TOV-112D, IGROV1, OVCA433, OVCAR8, OV90, SKOV3 and COV413B cells were treated with CDK7-inhibitor THZ1, then the cell proliferation viability and clone formation ability were detected by CCK-8 method and clone formation assay, respectively. Furthermore, the expression level of CDK7 protein and the phosphorylation level of RNA polymeraseⅡ (RNAPolⅡ) in IGROV1, OVCA433, SKOV3 and COV413B cells treated with THZ1 were analyzed by Western blotting. Results: The proliferation and clone formation abilities of various ovarian cancer cells were significantly decreased after CDK7 gene was silenced or knocked out (all P < 0.05). THZ1 repressed the proliferation and clone formation of ovarian cancer cells, and downregulated the expression of CDK7 and the phosphorylation of RNAPolⅡ (all P < 0.05). Conclusion: CDK7 may promote the proliferation of ovarian cancer cells by regulating the phosphorylation of RNAPolⅡ.
[Key words]     Ovarian neoplasms     Cell proliferation     Gene silencing     Gene knockout techniques     Cyclin-dependent kinases    

目前,卵巢癌居女性生殖系统肿瘤死因的首位,全世界每年新发病例数为23.9万[1],而死亡人数超过15万[1]。卵巢癌患者死亡率高主要是由于早期诊断困难、复发率高以及缺乏有效的治疗方式。传统化疗作为治疗卵巢癌的主要手段之一,其发展已达平台期。近年来,以抗血管生成药物和聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶抑制剂为代表的分子靶向药物治疗卵巢癌已取得了一定成效,在此基础上人们期待发现更多的分子靶点和靶向药物。

细胞周期蛋白依赖性激酶7(cyclin-dependent kinase 7,CDK7)属于CDK家族,是一种蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶,其主要有两大功能:(1)磷酸化RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ,RNAPolⅡ)的羧基末端结构域,调节细胞中基因转录;(2)作为CDK活化激酶的组成部分,磷酸化并激活所有CDK,其中包括细胞周期相关的CDK亚家族。CDK7是在基因转录起始时,参与构成转录因子ⅡH(transcription factor Ⅱ H,TFⅡH),以及磷酸化RNAPolⅡ羧基末端结构域中52个七肽重复序列(Y1S2P3T4S5P6S7)的第5和第7位丝氨酸残基(RNAPolⅡ S5/7)[2-3],也可磷酸化第2位丝氨酸残基,从而调控目的基因转录。

由于肿瘤细胞特别依赖基因转录过程,而CDK7调节RNAPolⅡ介导的目的基因转录起始,因此推测CDK7在许多恶性肿瘤中发挥重要作用。已有研究表明,CDK7在乳腺癌中表达上调,和雌激素受体表达相关[4],而且可促进胃癌细胞的增殖[5]和转移[6]。那么,CDK7在卵巢癌中的作用如何,目前尚无相关报道。本研究一方面通过特异性siRNA转染沉默卵巢癌细胞中CDK7基因表达,或应用成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)及其相关核酸内切酶9(CRISPR-associated endonuclease 9,Cas 9)基因编辑系统敲除CDK7基因,检测CDK7基因对卵巢癌细胞增殖的作用;另一方面用CDK7抑制剂处理卵巢癌细胞后检测细胞增殖以及CDK7蛋白表达和RNAPolⅡ磷酸化水平,以期探究CDK7作用卵巢癌细胞的可能的分子机制。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

胎牛血清和RPMI 1640培养液购自美国Gibco公司。CCK-8试剂盒购自日本株式会社同仁化学研究所。结晶紫购自生工生物工程(上海)股份有限公司。4%多聚甲醛溶液购自上海威奥生物科技有限公司。限制性内切酶FastDigest BsmBⅠ、去磷酸化酶FastAP、转染试剂LipofectAMINE® RNAiMAX Reagent、LipofectAMINETM 2000、无血清培养液(Opti-MEM® medium)和BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司。硝酸纤维素膜购自美国Bio-Rad公司。凝胶回收试剂盒购自美国MP Biomedicals公司。T4多聚核苷酸激酶和T4 DNA连接酶购自英国NEB公司。Stbl3感受态细胞和质粒小量提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。聚凝胺(polybrene)、滤膜(孔径为0.25 μm及0.45 μm)、大鼠抗人RNAPolⅡS5单克隆抗体和ECL试剂盒购自德国Millipore公司。嘌呤霉素(puromycin)购自美国Sigma公司。质粒中量抽提试剂盒购自德国Qiagen公司。小鼠抗人CDK7单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的兔抗人Actin和Tublin单克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。CDK7抑制剂THZ1购自美国MedChem Express公司。所有PCR引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成。基因敲除载体lentiCRISPRv2、包装质粒Δ8.9和包膜质粒VSVG购自美国Genentech公司。

1.2 细胞及其培养

卵巢癌细胞系OVCA433、TOV-112D、IGROV1、HEY、OVCA420、OVCAR8、OV90、SKOV3和COV413B来源于美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。细胞均用含10%胎牛血清、100 mmol/L丙酮酸钠、200 mmol/L谷氨酰胺、10 kU/mL青霉素和10 mg/mL链霉素的RPMI 1640培养液,置于37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下常规培养,每3~4 d换液1次,待细胞生长至融合度为80%时传代,收集处于对数生长期的细胞用于实验。另外,用于病毒包装和扩增的人源胚胎肾细胞HEK-293T含有SV40 T抗原,其培养方式同卵巢癌细胞系。

1.3 CDK7基因特异性siRNA转染卵巢癌细胞

将卵巢癌OVCA433、TOV-112D和IGROV1细胞接种于6孔板中,当细胞生长至融合度为60%~80%时,开始进行siRNA转染。每种细胞均设立3组,每组3个复孔,分别为阴性对照(negative control,NC)-siRNA转染组、特异性针对CDK7基因的siRNA-1和siRNA-2转染组(分别命名为siCDK7-1和siCDK7-2组)。首先将9 μL LipofectAMINE RNAiMAX Reagent加入150 μL无血清培养液(Opti-MEM® medium)中稀释,同时将3 μL各组siRNA加入150 μL无血清培养液中稀释。然后将这2种稀释液混合,室温孵育20 min后,小心加入6孔板中,细胞培养3 d后即可进行后续实验。

1.4 CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除卵巢癌细胞中CDK7基因

收集卵巢癌HEY、OVCA420、OVCA433和IGROV1细胞,每种细胞均设立3组,分别为靶向增强型绿色荧光蛋白的小向导RNA序列(small guide-enhanced green fluorescent protein,sgEGFP)对照组、靶向敲除CDK7基因的小向导RNA序列(small guide-CDK7,sgCDK7)-1和sgCDK7-2实验组。其中sgEGFP引物正向序列为5’-CACCGGAAGTTCGAGGGCGACACCC-3’,反向序列为5’-AAACGGGTGTCGCCCTCGAACTTCC-3’;sgCDK7-1引物正向序列为5’-CACCGAGCTCCAAATAGTAACTCGG-3’,反向序列为5’-AAACCCGAGTTACTATTTGGAGCTC-3’;sgCDK7-2引物正向序列为5’-CACCGATCT-CTGGCCTTGTAAACGG-3’,反向序列为5’-AAACCCGTTTACAAGGCCAGAGATC-3’。用FastDigest BsmBⅠ和FastAP酶切lentiCRISPRv2质粒,电泳分离后回收纯化大片段载体;引物寡核苷酸链退火,条件为37 ℃ 30 min,95 ℃ 5 min,然后以5 ℃/min的速度降温至25 ℃;用T4 DNA连接酶将退火产物与大片段载体连接过夜,然后转化Stbl3感受态细胞;挑取克隆培养并小量抽提质粒,送铂尚生物技术(上海)有限公司测序验证后中量抽提质粒。

按LipofectAMINETM 2000试剂说明书提供的方法将抽提质粒与包装质粒Δ8.9和包膜质粒VSVG以1:2.3:0.2的质量比混合,然后转染HEK-293T细胞。收集病毒上清液并感染卵巢癌HEY、OVCA420、OVCA433和IGROV1细胞,感染2 d后,加入嘌呤霉素筛选,获得稳定感染细胞系。

1.5 THZ1处理卵巢癌细胞

将卵巢癌TOV-112D、IGROV1、OVCA433、OVCAR8和OV90细胞接种于96孔板,置于37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下常规培养,第2天观察细胞贴壁生长良好,细胞融合度约为20%~30%。加入浓度分别为0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10 μmol/L的THZ1,处理细胞5 d。另外,收集卵巢癌TOV-112D、IGROV1和OVCA433细胞,接种于6孔板,常规培养至融合度为30%~50%时,用0.01、0.03、0.1、0.3和1 μmol/L的THZ1处理4 d;收集卵巢癌IGROV1、OVCA433、SKOV3和COV413B细胞,接种于6孔板,常规培养至融合度为50%时,用0.5 μmol/L THZ1处理0、4、8、12和24 h。每个细胞系的每个处理浓度均设4个复孔。

1.6 蛋白质印迹法检测CDK7表达和RNAPolⅡS5磷酸化水平

收集各siRNA转染后的卵巢癌OVCA433、TOV-112D和IGROV1细胞,加入RIPA裂解液裂解细胞,超声后离心取上清液,用BCA试剂盒测定蛋白浓度并统一定量。各细胞总蛋白上样,进行10% SDS-PAGE分离,电泳结束后,将分离后的蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上,用含5%脱脂牛奶的封闭液室温封闭30 min;加入鼠抗人CDK7单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的兔抗人Actin单克隆抗体(体积稀释比例均为1:1 000),4 ℃孵育过夜,TBST洗膜3次;加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠多克隆抗体(体积稀释比例为1:2 000),室温反应2 h,TBST洗膜3次,用ECL试剂盒显影。扫描图像后,用Image Lab软件分析蛋白条带灰度值,以目的蛋白条带灰度值与内参照Actin蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。

收集CDK7基因敲除后的卵巢癌HEY、OVCA420、OVCA433和IGROV1细胞,用上述方法检测CDK7及Tublin的表达水平。其中,辣根过氧化物酶标记的兔抗人Tublin单克隆抗体的体积稀释比例为1:1 000。

收集0.5 μmol/L THZ1处理0、4、8、12和24 h后的卵巢癌IGROV1、OVCA433、SKOV3和COV413B细胞,如上述方法检测RNAPolⅡS5、CDK7及Tublin的表达水平。其中,大鼠抗人RNAPolⅡS5单克隆抗体的体积稀释比例为1:1 000,辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠IgG的体积稀释比例为1:6 000。

1.7 CCK-8法检测细胞增殖活性

收集各siRNA转染后的卵巢癌OVCA433、TOV-112D和IGROV1细胞,以及用THZ1处理5 d后的卵巢癌TOV-112D、IGROV1、OVCA433、OVCAR8和OV90细胞,分别接种于96孔板,细胞融合度为30%。细胞置于37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下常规培养4 d后,加入事先配置好的含5% CCK-8液的RPMI 1640培养液(100 μL/孔),继续孵育2 h,然后用酶联免疫检测仪于450 nm波长处测定吸光度(D450 nm值),应用Graphpad Prism6.0软件分析细胞增殖活性。

1.8 平板克隆形成实验检测卵巢癌细胞的克隆形成能力

收集CDK7基因敲除的卵巢癌HEY、OVCA420、OVCA433和IGROV1细胞,以及THZ1处理4 d后的卵巢癌TOV-112D、IGROV1和OVCA433细胞。细胞计数后分别接种于直径为6 cm的培养皿中,细胞密度约(2~3)×105个/皿,置于37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下常规培养7~10 d。在光学显微镜下观察细胞形态,然后用4%多聚甲醛溶液固定,并进行结晶紫染色。清洗培养皿并晾干,扫描,用含10%甲醇和10%乙酸的混合液脱色,测量595 nm波长处的吸光度(D595nm值),进行定量分析。

1.9 统计学方法

采用Graphpad Prism 6.0软件对各实验结果数据进行统计学分析。所有实验均独立重复3次,多组间比较采用单因素方差分析,组内两两相比采用LSD-t检验;两组间比较采用双侧t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 CDK7基因沉默后卵巢癌细胞的增殖能力减弱

转染特异性针对CDK7基因的siRNA(包括siCDK7-1和siCDK7-2)后,蛋白质印迹法检测结果(图 1A)显示,卵巢癌OVCA433、TOV-112D和IGROV1细胞中CDK7蛋白的表达水平比阴性对照组(转染NC-siRNA)明显降低,差异均有统计学意义(P值均<0.05),说明siRNA转染后CDK7基因沉默效果尚可。

图 1 蛋白质印迹法(A)和CCK-8法(B)分别检测siRNA转染后卵巢癌细胞中CDK7蛋白表达水平和细胞增殖活性 Fig. 1 The expression level of cyclin-dependent kinase 7 (CDK7) protein and the proliferation activity of ovarian cancer OVCA433, TOV-112D and IGROV1 cells after transfection with the specific siRNA were detected by Western blotting (A) and CCK-8 assay (B), respectively. NC-siRNA: Transfected with the negative control siRNA as the control; siCDK7-1/2: Transfected with the specific siRNA-1/2 targeting CDK7 gene. The results showed that the expression of CDK7 gene was significantly down-regulated, and the proliferation ability was significantly inhibited after transfection with CDK7-siRNA-1/2 (*P < 0.05, vs NC-siRNA; n=3).

CCK-8检测结果(图 1B)显示,与阴性对照组相比,CDK7基因被沉默后,siCDK7-1和siCDK7-2组卵巢癌细胞的增殖能力均明显减弱(P值均<0.05)。

2.2 CDK7基因敲除后卵巢癌细胞的增殖能力减弱

应用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除卵巢癌细胞中的CDK7基因后,蛋白质印迹法检测结果(图 2A)显示,sgCDK7-1和sgCDK7-2组卵巢癌HEY、OVCA420、OVCA433和IGROV1细胞中CDK7蛋白表达水平比sgEGFP对照组明显降低(P值均<0.05),说明CDK7基因敲除效果尚可。

图 2 蛋白质印迹法(A)和平板克隆形成实验(B)分别检测CRISPR/Cas9系统敲除基因后CDK7蛋白表达和卵巢癌细胞的克隆形成能力 Fig. 2 The expression level of cyclin-dependent kinase 7 (CDK7) protein and the clone formation ability of ovarian cancer HEY, OVCA420, OVCA433 and IGROV1 cells after CDK7 gene knockout by clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated endonuclease 9 (Cas9) system were detected by Western blotting (A) and plate clone formation assay (crystal violet staining) (B), respectively. The bright field imaging in figure 2B showed the cell morphology (×100). sgEGFP: Infected with lentivirus carrying small guide-enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene as the control; sgCDK7-1/2: Infected with lentivirus carrying small guide-CDK7-1/2 sequence targeting CDK7 gene. The results showed that the CDK7 gene was knocked out, and the clone formation ability of ovarian cancer cells was significantly repressed after infection with lentivirus carrying sgCDK7-1/2 (*P < 0.05, vs sgEGFP; n=3).

平板克隆形成实验结果(图 2B)显示,CDK7基因敲除后的sgCDK7-1和sgCDK7-2组卵巢癌细胞活性降低,克隆形成能力减弱(P值均<0.05)。此外,光学显微镜下观察(图 2B)可见,CDK7基因敲除后卵巢癌细胞形态也发生了一定程度的改变,变得更大且不规则,细胞中出现许多小泡。

2.3 THZ1抑制卵巢癌细胞增殖

CDK7抑制剂THZ1处理卵巢癌TOV-112D、IGROV1、OVCA433、OVCAR8和OV90细胞后,CCK-8法检测结果(图 3A)显示,随着THZ1作用浓度的增加,卵巢癌细胞增殖能力逐渐降低(P值均<0.05);THZ1对各种卵巢癌细胞的半数抑制浓度为0.008~0.1 μmol/L。同样,用不同浓度的THZ1处理卵巢癌TOV-112D、IGROV1和OVCA433细胞后,平板克隆形成实验结果(图 3B)显示,THZ1处理组的细胞克隆形成均受到明显抑制(P值均<0.05),且呈一定的浓度依赖性。结果表明,CDK7蛋白在卵巢癌细胞增殖过程中发挥重要作用,使用其靶向抑制药物处理可抑制卵巢癌细胞增殖。

图 3 CCK-8法(A)和平板克隆形成实验(B)检测THZ1处理后卵巢癌细胞的增殖活性和克隆形成能力 Fig. 3 The proliferation viability and clone formation ability of ovarian cancer cells were detected by CCK-8 assay (A) and plate clone formation assay (crystal violet staining) (B) after treatment with THZ1. In CCK-8 assay, the ovarian cancer TOV-112D, IGROV1, OVCA433, OVCAR8 and OV90 cells were treated with 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3 and 10 μmol/L THZ1 for 5 d; In clone formation assay, the ovarian cancer TOV-112D, IGROV1 and OVCA433 cells were treated with 0.01, 0.03, 0.1, 0.3 and 1 μmol/L THZ1 for 4 d. The results showed that the proliferation and clone formation abilities of ovarian cancer cells were significantly repressed after treatment with THZ1 in a dose-dependent manner. [*P < 0.05, vs 0 μmol/L THZ1 (no treatment); n=3].

2.4 THZ1抑制CDK7蛋白表达及其介导的RNAPolⅡ磷酸化

用THZ1处理卵巢癌IGROV1、OVCA433、SKOV3和COV413B细胞不同时间(0~24 h)后,蛋白质印迹法检测结果(图 4)显示,CDK7蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义(P值均<0.05),RNAPolⅡ S5的磷酸化水平也明显降低(P值均<0.05),且有一定的时间依赖性。结果表明,THZ1抑制CDK7蛋白表达,进而可以抑制CDK7对RNAPolⅡ磷酸化水平的调节作用;进一步提示,CDK7可能通过调节RNAPolⅡ介导的基因转录过程,影响卵巢癌细胞增殖。

图 4 蛋白质印迹法检测THZ1处理后卵巢癌细胞中CDK7表达水平和RNAPolⅡ5S磷酸化水平 Fig. 4 The expression level of cyclin-dependent kinase 7 (CDK7) and the phosphorylation level of RNA polymeraseⅡ carboxyl-terminal domain Ser-5 (RNAPolⅡS5) in ovarian cancer cells treated with THZ1 were detected by Western blotting. After the ovarian cancer IGROV1, OVCA433, SKOV3 and COV413B cells were treated with 0.5 μmol/L THZ1 for 0, 4, 8, 12 and 24 h, the CDK7 expression and RNAPolⅡS5 phosphorylation levels were significantly down-regulated [*P < 0.05, vs 0 h (no treatment); n=3].

3 讨论

目前,卵巢癌的主要治疗方式是肿瘤细胞减灭术和铂类药物为基础的化疗;应用这些方法治疗后,25%的卵巢癌患者仍会在6个月内复发[7],并对铂类药物产生耐药性,化疗效果进入平台期。随着精准医学概念的提出,研究者们开始不断探索靶向药物治疗卵巢癌的新途径。例如,有研究显示,聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶抑制剂奥拉帕尼治疗乳腺癌易感基因1/2突变的卵巢癌患者,结果显示疗效显著[8]。然而,卵巢癌缺乏高频致癌基因突变,不同组织类型的卵巢癌基因突变谱差别较大[9],使得分子靶向药物的研究面临巨大挑战。

CDK7属于细胞周期蛋白依赖性激酶家族,其调节基因转录和细胞周期进程。在许多肿瘤中,CDK7表达可促进细胞增殖和肿瘤转移。CDK7抑制剂有BS-181、LDC3140和LDC4297等。2014年,Kwiatkowski等[10]通过激酶抑制剂筛选发现了一种新的CDK7抑制剂,即THZ1。THZ1通过其丙烯酰胺残基,不可逆地与CDK7蛋白中经典的激酶结构域外半胱氨酸残基结合,抑制CDK7活性。与传统的CDK抑制剂不同,THZ1结合CDK7的位点位于经典的激酶结构域以外,其特异性较高,并且这种结合是不可逆的。研究表明,在MYCN基因扩增的成神经细胞瘤[11]、Myc和神经内分泌家系特异性细胞因子驱动的小细胞肺癌[12]、三阴性乳腺癌[13]和食管鳞状细胞癌[14]中,THZ1都能通过抑制CDK7来影响基因转录,发挥相对高效且低毒的抗癌作用。THZ1的抗癌机制可能是,肿瘤细胞存在失控的持续增殖,往往依赖于高水平的基因转录[15],而CDK7通过RNAPolⅡ调节基因转录,因此用THZ1抑制CDK7表达,即可抑制肿瘤增殖所依赖的基因转录,从而达到治疗肿瘤的目的。

目前,CDK7在卵巢癌中的作用尚不完全清楚,还有待进一步阐明。本研究通过特异性siRNA转染法和CRISPR/Cas9基因编辑系统沉默或敲除不同组织类型卵巢癌细胞中的CDK7基因,采用CCK-8和平板克隆形成实验检测卵巢癌细胞的增殖活性和克隆形成能力变化。结果表明,沉默或敲除CDK7基因后,卵巢癌细胞增殖和克隆形成能力均减弱。鉴于CDK7可调节基因转录过程,因此推测,CDK7可能通过调节卵巢癌细胞中基因转录,影响细胞增殖能力。

为验证CDK7对卵巢癌细胞增殖的作用,并探究其作用机制,本研究用CDK7抑制剂THZ1处理卵巢癌细胞,并采用平板克隆形成实验检测细胞增殖,以及采用蛋白质印迹法检测相关蛋白表达的改变。结果表明,THZ1抑制卵巢癌细胞增殖,并且下调CDK7蛋白表达以及RNAPolⅡS5磷酸化。结果提示,THZ1可能通过抑制CDK7基因表达,影响RNAPolⅡ磷酸化及其调控的基因转录,从而抑制卵巢癌细胞增殖。

综上所述,本研究运用体外实验初步揭示了CDK7对卵巢癌细胞增殖具有促进作用。然而,本研究结果还需要进一步的体内实验加以验证。此外,为了全方位地阐明CDK7在卵巢癌中的具体作用机制,探究其是否有望成为卵巢癌治疗靶点,还需深入探讨CDK7对卵巢癌细胞迁移和侵袭等其他方面的影响。而且,由于THZ1抑制基因转录是一个普遍的细胞生物学过程,因此其对正常细胞是否有毒性还有待进一步研究阐明。

参考文献
[1]
Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2): 87-108. DOI:10.3322/caac.21262
[2]
Nilson KA, Guo J, Turek ME, et al. THZ1 reveals roles for Cdk7 in co-transcriptional capping and pausing[J]. Mol Cell, 2015, 59(4): 576-587. DOI:10.1016/j.molcel.2015.06.032
[3]
Kelso TW, Baumgart K, Eickhoff J, et al. Cyclin-dependent kinase 7 controls mRNA synthesis by affecting stability of preinitiation complexes, leading to altered gene expression, cell cycle progression, and survival of tumor cells[J]. Mol Cell Biol, 2014, 34(19): 3675-3688. DOI:10.1128/MCB.00595-14
[4]
Patel H, Abduljabbar R, Lai CF, et al. Expression of CDK7, Cyclin H, and MAT1 is elevated in breast cancer and is prognostic in estrogen receptor-positive breast cancer[J]. Clin Cancer Res, 2016, 22(23): 5929-5938. DOI:10.1158/1078-0432.CCR-15-1104
[5]
Wang Q, Li M, Zhang X, et al. Upregulation of CDK7 in gastric cancer cell promotes tumor cell proliferation and predicts poor prognosis[J]. Exp Mol Pathol, 2016, 100(3): 514-521. DOI:10.1016/j.yexmp.2016.05.001
[6]
Naseh G, Mohammadifard M, Mohammadifard M. Upregulation of cyclin-dependent kinase 7 and matrix metalloproteinase-14 expression contribute to metastatic properties of gastric cancer[J]. IUBMB Life, 2016, 68(10): 799-805. DOI:10.1002/iub.1543
[7]
Miller DS, Blessing JA, Krasner CN, et al. PhaseⅡ evaluation of pemetrexed in the treatment of recurrent or persistent platinum-resistant ovarian or primary peritoneal carcinoma:a study of the Gynecologic Oncology Group[J]. J Clin Oncol, 2009, 27(16): 2686-2691. DOI:10.1200/JCO.2008.19.2963
[8]
Yap TA, Sandhu SK, Carden CP, et al. Poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitors:Exploiting a synthetic lethal strategy in the clinic[J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(1): 31-49. DOI:10.3322/caac.v61:1
[9]
Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma[J]. Nature, 2011, 474(7353): 609-615. DOI:10.1038/nature10166
[10]
Kwiatkowski N, Zhang T, Rahl PB, et al. Targeting transcription regulation in cancer with a covalent CDK7 inhibitor[J]. Nature, 2014, 511(7511): 616-620. DOI:10.1038/nature13393
[11]
Chipumuro E, Marco E, Christensen CL, et al. CDK7 inhibition suppresses super-enhancer-linked oncogenic transcription in MYCN-driven cancer[J]. Cell, 2014, 159(5): 1126-1139. DOI:10.1016/j.cell.2014.10.024
[12]
Christensen CL, Kwiatkowski N, Abraham BJ, et al. Targeting transcriptional addictions in small cell lung cancer with a covalent CDK7 inhibitor[J]. Cancer Cell, 2014, 26(6): 909-922. DOI:10.1016/j.ccell.2014.10.019
[13]
Wang Y, Zhang T, Kwiatkowski N, et al. CDK7-dependent transcriptional addiction in triple-negative breast cancer[J]. Cell, 2015, 163(1): 174-186. DOI:10.1016/j.cell.2015.08.063
[14]
Jiang YY, Lin DC, Mayakonda A, et al. Targeting super-enhancer-associated oncogenes in oesophageal squamous cell carcinoma[J/OL]. Gut, 2016(2016-05-10)[2017-05-01]. http://gut.bmj.com/content/early/2016/05/10/gutjnl-2016-311818.long.doi:10.1136/gutjnl-2016-311818.
[15]
Bradner JE, Hnisz D, Young RA. Transcriptional addiction in cancer[J]. Cell, 2017, 168(4): 629-643. DOI:10.1016/j.cell.2016.12.013