2021年, 第41卷, 第09期　刊出日期：2021-09-25

  

• 全选
  |

原创研究
• Select
  TRIM59激活β-catenin/TCF4信号通路促进骨肉瘤细胞的侵袭和迁移

  祝开忠, 陈　涛, 陈焕雄, 王挺锐, 钟贞浩

  肿瘤. 2021, 41(09): 581-590. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2021.2004-0307

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  目的 ：研究三结构域家族蛋白 59（tripartite motif family protein 59，TRIM59）在骨肉瘤组织细胞中的表达情况，并探讨其对骨肉瘤侵袭及迁移的影响及可能的分子作用机制。

  方法 ：采用蛋白质印迹法及实时荧光定量 PCR 法检测骨肉瘤组织及细胞中 TRIM59 的表达水平，并通过免疫组织化学法检测骨肉瘤及相应癌旁组织中 TRIM59 蛋白的表达水平。通过病毒感染的方法将携带有特异性针对 TRIM59 基因的 shRNA（shTRIM59）和阴性对照 shNC 转入骨肉瘤U2-OS 细胞，采用 Transwell 小室及划痕愈合实验检测沉默 TRIM59 基因表达对 U2-OS 细胞侵袭及迁移能力的影响，蛋白质印迹法检测对上皮 - 间质转化相关蛋白 E- 钙黏蛋白（E-cadherin）、N- 钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）表达水平及 Wnt/β- 连环蛋白（β-catenin）信号通路相关蛋白 β-catenin 和转录因子 4（transcription factor 4，TCF4）表达的影响，最后通过体内实验观察 TRIM59 基因沉默对骨肉瘤细胞肺转移的影响。通过病毒感染的方法将 TRIM59 基因过表达载体转入骨肉瘤 143B 细胞中，同时采用 β-catenin 信号通路抑制剂 XAV939 处理 TRIM59 过表达的细胞，再用蛋白质印迹法检测 β-catenin 和 TCF4 蛋白的表达水平，Transwell 小室及划痕愈合实验检测骨肉瘤细胞侵袭及迁移能力的变化情况。

  结果 ：骨肉瘤组织及细胞中 TRIM59 mRNA 及蛋白的表达水平均明显升高（P 均＜ 0.01）。下调骨肉瘤 U2-OS 细胞中 TRIM59 的表达水平后，Transwell 小室及划痕愈合实验均表明其侵袭及转移能力减弱（P 均＜ 0.01），U2-OS 细胞中 N-cadherin 和 Vimentin 蛋白的表达水平明显下调，E-cadherin 蛋白的表达水平明显上调（P 均＜ 0.05）；同时 β-catenin 和 TCF4 蛋白的表达水平均明显下调（P 均＜ 0.05），小鼠体内实验也证实下调 TRIM59 表达后骨肉瘤细胞肺部转移的发生率降低。上调 TRIM59 表达后，β-catenin 和 TCF4 蛋白的表达水平均明显上调（P 均＜ 0.05），细胞的侵袭和迁移能力均明显提高（P 均＜ 0.05），但 XAV939 能明显抑制 β-catenin 和 TCF4蛋白的表达水平，进而恢复抑制骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力（P 均＜ 0.05）。

  结论 ：TRIM59 在骨肉瘤组织及细胞中高表达，TRIM59 可能通过激活 β-catenin/TCF4 信号通路调控体内外骨肉瘤细胞转移的发生。TRIM59 可能是骨肉瘤治疗上一个潜在新的靶点。
• Select
  二甲双胍诱导的干细胞样记忆性嵌合抗原受体-T细胞对小鼠多发性骨髓瘤移植瘤的治疗作用

  董一唯, 孙艳莎, 李宗海, 蒋　华

  肿瘤. 2021, 41(09): 591-603. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2021.2103-0138

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  目的 ：探讨体外培养过程中加入二甲双胍对靶向 B 细胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）的嵌合抗原受体 -T 细胞（chimeric antigen receptor-T cells，CAR-T）分化及抗肿瘤能力的影响。

  方法 ：从健康人外周血单个核细胞中提取并活化 T 细胞，采用病毒感染法制备 BCMA-BBZ CAR-T 细胞。二甲双胍诱导组为 CAR-T 细胞扩增过程同时加入重组人白细胞介素 7（recombinant human interleukin-7，rhIL-7）、rhIL-21 和二甲双胍进行诱导，非二甲双胍诱导组为只使用细胞因子诱导的 CAR-T 细胞，空白对照组为未转导慢病毒的 T 细胞。采用 FCM 法检测CAR-T 细胞中 CAR 的表达水平、记忆表型和凋亡情况，非放射性细胞毒性实验评价 CAR-T 细胞对人多发性骨髓瘤 RPMI-8226 细胞的特异性免疫杀伤作用。用 RPMI-8226 细胞连续多轮刺激后，检测 CAR-T 细胞的记忆表型和对 RPMI-8226 细胞的毒性杀伤功能。构建 RPMI-8226 细胞小鼠移植瘤模型，输注各组 CAR-T 细胞后，记录小鼠的肿瘤体积、体质量、生存期，检测 CAR-T 输注 14 d 后小鼠外周血中淋巴细胞数量。

  结果 ：二甲双胍诱导后的 CAR-T 细胞，CD8^＋ T 细胞中干细胞样记忆 T 细胞（stem-cell memory T cell，Tscm）（CD95high CD45RAhigh CCR7high）所占比例明显增多（P ＜ 0.05）。在经过连续 2 轮 RPMI-8226 细胞刺激后，CD8^＋ T 细胞中仍保持较高的 Tscm 比例。与未转染慢病毒的 T 细胞相比，二甲双胍诱导组和非二甲双胍诱导组 CAR-T 细胞均能有效抑制甚至清除肿瘤（P ＜ 0.01 和 P ＜ 0.000 1），但 2 组 CAR-T 细胞的疗效差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。进一步研究显示，相较于非二甲双胍诱导的 CAR-T 细胞治疗组二甲双胍诱导的 CAR-T 细胞治疗组小鼠外周血中 CD8^＋ T 细胞数明显更多（P ＜ 0.05），小鼠生存期也具有一定的存活受益。

  结论 ：二甲双胍具有维持 CAR-T 细胞低分化的作用，其诱导的 Tscm 富集可在连续培养和接受连续抗原刺激后维持。二甲双胍诱导的 CAR-T 细胞能够有效抑制肿瘤生长。
• Select
  E1B-55kDa基因缺陷型溶瘤腺病毒H101体外和体内抑制结肠癌HCT-116细胞增殖

  卞　京, 李夏伊, 郑于铭, 徐文晖, 朱美玲, 郑磊贞

  肿瘤. 2021, 41(09): 604-615. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2021.2102-0100

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  目的 ：研究 E1B-55kDa 基因缺陷型溶瘤腺病毒 H101 对结肠癌 HCT-116细胞及其裸鼠皮下移植瘤生长的影响，并探讨可能的作用机制。

  方法 ：使用不同效价的缺陷型溶瘤腺病毒 H101 作用于结肠癌 HCT-116、SW480 和 RKO 细胞 24、48 和 72 h 后，采用 CCK-8 法检测细胞的存活率。随后，用效价为 1.0×10⁷ vp/mL 的缺陷型溶瘤腺病毒 H101 处理 HCT-116细胞 72 h 后，在光学显微镜下观察细胞形态学变化，同时采用蛋白质印迹法检测 HCT-116 细胞中腺病毒衣壳蛋白 Hexon 的表达情况，以及 FCM法检测对细胞周期的影响。采用不同效价（1.0×10⁶ 和 2.5×10⁶ vp/mL）的缺陷型溶瘤腺病毒 H101 处理 HCT-116 细胞 48 h 后，通过细胞集落形成实验检测缺陷型溶瘤腺病毒 H101 对 HCT-116 细胞集落形成能力的影响，以及 Transwell 小室实验检测对 HCT-116 细胞的迁移和侵袭能力的影响。用 HCT-116 细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型，瘤内注射缺陷型溶瘤腺病毒H101，观察腺病毒对裸鼠移植瘤生长的影响，并采用免疫组织化学法检测 Ki-67 和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在移植瘤中的表达情况。

  结果 ：与对照组相比，缺陷型溶瘤腺病毒 H101 明显抑制 HCT-116 细胞的生长活力（P ＜ 0.05），且这种抑制作用呈一定的浓度和时间依赖性 ；而 SW480 和 RKO 细胞，仅在缺陷型溶瘤腺病毒 H101 效价高（1.0×10⁷ vp/mL）和作用时间长（72 h）时，对细胞的增殖具有抑制作用（P 均＜ 0.05）。缺陷型溶瘤腺病毒 H101（1.0×10⁷ vp/mL）处理 HCT-116 细胞 72 h 后，HCT-116 细胞失去正常形态，悬浮细胞数目增多，并出现细胞破裂导致膜内容物流出 ；HCT-116 细胞的集落形成能力明显降低（P ＜ 0.001）；缺陷型溶瘤腺病毒 H101 感染后可上调 HCT-116 细胞中腺病毒衣壳蛋白 Hexon 的表达水平（P ＜ 0.001），证明缺陷型溶瘤腺病毒 H101 可在 HCT-116 细胞中有效表达。缺陷型溶瘤腺病毒 H101 抑制 HCT-116 细胞的迁移和侵袭（P 均＜ 0.01），并将 HCT-116 细胞阻滞在 S 期（P ＜ 0.01）。缺陷型溶瘤腺病毒 H101 能明显抑制裸鼠皮下移植瘤的生长，移植瘤的体积和质量明显减小（P 均＜ 0.001），抑瘤率为 92.28%。HE 染色结果显示，与对照组相比，缺陷型溶瘤腺病毒 H101 治疗组移植瘤组织中细胞坏死范围更大。免疫组织化学法检测结果提示，缺陷型溶瘤腺病毒 H101 治疗组移植瘤中表达 Ki-67 和 VEGF 的细胞数均明显减少（P 均＜ 0.001），表明缺陷型溶瘤腺病毒 H101 具有显著的抑制肿瘤细胞增殖和抗肿瘤血管生成的作用。

  结论 ：E1B-55kDa 缺陷型溶瘤腺病毒 H101 对结肠癌 HCT-116 细胞具有显著的体外和体内抗肿瘤作用，是一个潜在的抗肿瘤药物。
• Select
  单细胞分析微环境与髓母细胞瘤预后的关系

  罗文钦, 杨　茹

  肿瘤. 2021, 41(09): 616-630. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2021.2103-0171

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  目的 ：利用单细胞测序数据分析微环境与髓母细胞瘤预后的关系，探讨微环境细胞对髓母细胞瘤发生和发展的影响。

  方法 ：收集 Patched^＋/－转基因小鼠髓母细胞瘤肿瘤组织和正常小鼠的小脑组织进行单细胞 RNA 测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）；从基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库中下载 M-Smo基因髓母细胞瘤小鼠模型的单细胞 RNA 数据。对所有单细胞 RNA 数据中的微环境细胞进行整合分析，并使用特异性标志基因识别细胞类型。采用χ2 检验比较正常小鼠和肿瘤小鼠，以及肿瘤小鼠维莫德吉（vismodegib）治疗组和对照组（vector）之间的微环境细胞数量差异。通过对微环境细胞群进行差异表达基因分析（differential gene expression analysis，DEG）获取细胞类型的相关基因集，对 GEO 数据库中髓母细胞瘤患者的 RNA 表达数据进行基因集变异分析（gene set variation analysis，GSVA），获取微环境细胞相关基因的 GSVA 得分，以 GSVA 得分表示微环境细胞相关基因的表达水平和微环境细胞的富集程度。基于微环境细胞相关基因得分，采用Kaplan-Meier 法分析微环境细胞相关基因表达水平与髓母细胞瘤患者预后的关系，随后采用热图聚类分析探讨患者微环境细胞富集程度与临床特征的关系。最后采用多因素 COX 比例风险模型分析可能成为患者总生存期影响因素的微环境细胞类型，从而探讨微环境细胞对髓母细胞瘤发生和发展的影响。

  结果 ：髓母细胞瘤小鼠模型中共检测到 6 种微环境细胞类型 ：T 细胞、成纤维细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞。其中，T 细胞和内皮细胞只在髓母细胞瘤小鼠模型中出现。与正常小鼠相比，髓母细胞瘤小鼠模型中少突胶质细胞和小胶质细胞所占百分比更高（P 均＜ 0.001），而星型胶质细胞所占百分比更低（P ＜ 0.001）；髓母细胞瘤小鼠模型的 vismodegib 治疗组与对照组相比，T 细胞、成纤维细胞和小胶质细胞所占百分比更高（P 均＜ 0.001），而内皮细胞和少突胶质细胞所占百分比更低（P 均＜ 0.001）。生存分析结果显示，成纤维细胞和小胶质细胞相关基因的高表达与患者的总生存时间呈现明显的负相关性（P 均＜ 0.05），而少突胶质细胞相关基因的高表达与患者的总生存时间呈现明显的正相关性（P ＝ 0.003）。结合生存分析结果同时基于 GSVA 得分，分析患者临床特征后发现富集成纤维细胞和小胶质细胞组患者预后较好（P ＝ 0.004），而富集少突胶质细胞组患者预后较差（P ＝ 0.004）；COX 多因素风险回归模型分析结果显示，少突胶质细胞的富集和患者出现转移都是影响总生存时间的独立危险因素 [ 风险比（hazard ratio，HR）值均＞ 1，P 均＜ 0.05]，而成纤维细胞的富集和患者不出现转移是影响总生存时间的保护因素（HR 值均＜ 1，P 均＜ 0.05）。

  结论 ：肿瘤微环境中小胶质细胞和成纤维细胞的存在可改善患者的预后，可能发挥抑制髓母细胞瘤发生和发展的作用，而少突胶质细胞的存在可使患者的预后较差，可能发挥促进髓母细胞瘤发生和发展的作用，提示靶向干预这 3 类微环境细胞对肿瘤细胞的调控机制可能对治疗髓母细胞瘤具有重要意义。
• Select
  沉默NRF2基因表达及鸦胆子苦醇均可抑制人胆管癌RBE细胞增殖

  潘若谷, 李可为

  肿瘤. 2021, 41(09): 631-639. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2021.2104-0199

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  目的 ：探讨核因子 E2 相关因子 2（nuclear factor E2-related factor 2，NRF2）在人胆管癌细胞株 RBE 细胞增殖中的作用，以及鸦胆子苦醇（brusatol）对 RBE 细胞增殖的影响。

  方法 ：利用 UALCAN 数据库检索 NRF2 在正常人胆道组织和胆管癌组织中的表达情况 ；分别采用实时荧光定量 PCR 和蛋白质印迹法检测人胆管癌细胞株 RBE 和正常胆管上皮 H69 细胞中 NRF2 mRNA 和蛋白的表达水平。采用脂质体转染法将靶向 NRF2 基因的 siRNA（siNRF2-1 和 siNRF2-2）转入 RBE 细胞，分别采用实时荧光定量 PCR 和蛋白质印迹法检测 RBE 细胞中 NRF2 mRNA 和蛋白的表达情况。采用 DCFH-DA 探针法检测沉默 NRF2 表达对 RBE 细胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的影响。CCK-8 法和平板克隆形成实验检测沉默 NRF2 表达对 RBE 细胞增殖的影响。最后，再用 CCK-8 法检测鸦胆子苦醇对 RBE 细胞增殖的影响，实时荧光定量 PCR 和 DC-FHDA 探针法分别检测鸦胆子苦醇对 RBE 细胞中 NRF2 mRNA 表达水平的影响以及细胞内 ROS 水平的影响。

  结果 ：NRF2 在胆管癌组织中的表达水平明显高于正常胆管组织（P ＜ 0.05）。人胆管癌细胞株 RBE 中 NRF2 mRNA 和蛋白的表达水平均较正常胆管上皮 H69 细胞明显上调（P ＜ 0.001 和 P ＜ 0.01）。siNRF2-1 和 siNRF2-2 均能明显下调 RBE 细胞中 NRF2 mRNA 和蛋白的表达水平均（P 均＜ 0.01）。沉默 NRF2 表达能有效提高 RBE 细胞中的 ROS 含量（P 均＜ 0.05），而抑制 RBE 细胞的增殖能力（P 均＜ 0.01）。鸦胆子苦醇能够有效抑制 RBE细胞的增殖能力（P ＜ 0.01），下调 RBE 细胞中 NRF2 mRNA 的表达水平（P ＜ 0.01）以及提高 RBE 细胞中的 ROS 含量（P ＜ 0.01）。

  结论 ：NRF2 在胆管癌中表达增加，沉默 NRF2 基因表达以及鸦胆子苦醇均能有效提高人胆管癌 RBE 细胞内 ROS 的含量并抑制胆管癌细胞增殖，因此 NRF2 有望成为胆管癌治疗的一个重要靶点，而鸦胆子苦醇有望成为临床上治疗胆管癌的一个新药。
综述
• Select
  靶向CD47抗肿瘤治疗的研究进展

  柳菁菁, 唐辰晨, 李　慧, 程　颖

  肿瘤. 2021, 41(09): 640-649. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2021.2102-0099

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  CD47 是一种广泛表达于多种细胞膜表面的免疫球蛋白样蛋白质，CD47 激活后可以介导细胞增殖、迁移、吞噬以及细胞凋亡。多种肿瘤细胞高表达 CD47，其与巨噬细胞表面的信号调节蛋白 α（signal regulatory protein α，SIRPα）结合后，发出“别吃我”信号，从而逃避巨噬细胞的监视，达到免疫逃逸的目的。近年来，CD47 已成为肿瘤免疫治疗热门研发靶点之一，并有多个新药正在研发中。本文将就 CD47 的结构和功能、CD47 参与的抗肿瘤生物学效应、靶向 CD47 新药的研究现状和进展进行概述，并对该治疗领域的未来应用前景予以展望。
• Select
  β-肾上腺素能受体在肿瘤发生和发展中的研究进展

  李晓燕, 李亚星, 贾漪涛

  肿瘤. 2021, 41(09): 650-656. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2021.2010-0897

  摘要 ( ) PDF全文 ( )   可视化   收藏

  β- 肾上腺素能受体（β-adrenergic receptor，β-AR）是一种 G 蛋白偶联受体，表达于多种肿瘤细胞上，其中以 β2-AR 亚型为主。儿茶酚胺与 β-AR相互作用可通过多种途径促进肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭及迁移，从而影响肿瘤的发生和发展。近期研究发现，β-AR 也广泛表达于免疫细胞上，并可通过调控免疫细胞的功能影响肿瘤免疫微环境进而影响肿瘤的发生和发展。临床研究发现，β-AR 的表达与肿瘤患者的预后密切相关，应用 β-AR阻滞剂既能降低部分肿瘤患者的死亡率，又具有降低化疗的耐药性、提高放疗敏感性、与免疫检查点抑制剂协同抗肿瘤作用，因此靶向 β-AR 是肿瘤治疗的新选择。本文将就 β-AR 在肿瘤发生和发展中的作用作一综述。