2021年, 第41卷, 第10期　刊出日期：2021-10-25

  

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原创研究
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  硫酸右旋糖苷通过抑制M2型巨噬细胞极化以减弱M2型巨噬细胞对HGC-27胃癌细胞侵袭和迁移的促进作用

  郭嘉欣, 李梦琪, 赵　媛, 陶月佳, 李　冰, 徐远义, 黄允宁

  肿瘤. 2021, 41(10): 657-669. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2021.2011-0961

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  目的 ：探讨硫酸右旋糖苷（dextran sulfate，DS）对 M2 型巨噬细胞极化以及 M2 型巨噬细胞促进胃癌细胞侵袭和迁移的影响，观察 M2 型巨噬细胞在胃癌组织中的浸润情况并评估其临床意义。

  方法 ：采用佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）、白细胞介素4（interleukin-4，IL-4）和 IL-13 体外诱导人单核细胞 THP-1 极化为巨噬细胞（M0 和 M2 型），应用免疫细胞荧光及蛋白质印迹法进行验证。在巨噬细胞诱导和极化过程中加入 DS，采用蛋白质印迹法检测 DS 对 M2 型巨噬细胞标志物 CD206 和 CD163 蛋白表达的影响，Transwell 小室迁移实验检测 DS 对巨噬细胞趋化募集能力的影响。建立巨噬细胞与 HGC-27 胃癌细胞共培养模型，将 HGC-27 胃癌细胞与经 DS 处理或未处理的巨噬细胞（M0 和 M2 型）进行共培养，然后分别采用划痕愈合实验和 Transwell 小室侵袭实验检测 HGC-27 胃癌细胞的迁移和侵袭能力，应用蛋白质印迹法检测侵袭和迁移相关蛋白的表达情况。采用免疫组织化学法检测人胃癌组织中M2型巨噬细胞的浸润情况，并分析浸润程度与临床病理特征之间的关系。

  结果 ：采用 PMA、IL-4 和 IL-13 成功诱导 THP-1 细胞极化为 M0 和 M2型巨噬细胞。DS 可以抑制 M2 型巨噬细胞的极化过程，下调 M2 型巨噬细胞中 CD206 和 CD163 蛋白的表达水平（P ＜ 0.001 和 P ＜ 0.05），以及抑制 M2 型巨噬细胞的趋化募集能力（P ＜ 0.001）。M2 型巨噬细胞可以促进 HGC-27 胃癌细胞的迁移和侵袭能力，并且上调 HGC-27 胃癌细胞中 N- 钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和基质金属蛋白酶 2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的表达水平（P ＜ 0.05 或 P ＜ 0.001）。DS 干预 M2 型巨噬细胞的极化过程后，可以明显减弱 M2 型巨噬细胞对HGC-27 胃癌细胞侵袭和迁移的促进作用（P ＜ 0.01 或 P ＜ 0.001）。人胃癌组织中 M2 型巨噬细胞的浸润程度高于正常胃黏膜组织（P ＜ 0.01），并且 M2 型巨噬细胞的浸润程度与胃癌的分化程度和分期相关（P 均＜ 0.05）

  结论 ：DS 能够抑制 M2 型巨噬细胞的极化，减弱其对胃癌细胞趋化募集的应答能力，抑制 M2 型巨噬细胞对胃癌细胞侵袭和迁移能力以及侵袭和迁移相关蛋白表达的促进能力。
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  RASSF1A促进DLD-1细胞凋亡和线粒体自噬并抑制DLD-1细胞增殖和黏附

  胡　斐, 陈　丽, 马　萍, 唐文如, 盛苗苗

  肿瘤. 2021, 41(10): 670-683. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2021.2007-0637

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  目的：探讨 Ras- 结合结构域家族蛋白 1A（Ras-association domain family 1A，RASSF1A）对结直肠癌细胞 DLD-1 凋亡、增殖、线粒体自噬及细胞黏附的影响以及可能的作用机制。

  方法：采用亚硫酸氢盐测序（bisulfite sequencing PCR，BSP）法检测 5 株结直肠癌细胞（DLD-1、HCT116、HT-29、LoVo 和 SW480）中RASSF1A 基因的甲基化情况，实时荧光定量 PCR 检测 DLD-1、HCT116 和 HT-29 细胞中 RASSF1A mRNA 的表述水平。采用脂质体法将携带有 RASSF1A 基因的重组载体 pEAK13-RASSF1A 转入 DLD-1 细胞 ；随后分别采用 FCM 法、DCFH-DA 探针法、JC-1 法及 CCK-8 法检测 RASSF1A 过表达对 DLD-1 细胞凋亡、细胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平、线粒体膜电位及细胞增殖的影响，蛋白质印迹法检测凋亡、线粒体自噬、细胞增殖及黏附相关蛋白的表达水平。

  结果：DLD-1 细胞中 RASSF1A 基因发生甲基化，DLD-1 细胞中未能检测到 RASSF1A mRNA 的表达。在 DLD-1 细胞中瞬时转入重组 pEAK13-RASSF1A 过表达质粒恢复 RASSF1A 表达后，在 24、48 和 72 h 时均检测发现 DLD-1 细胞的凋亡率明显提高（P 均＜ 0.05）。Bcl-2 和 Bax 蛋白的表达水平均明显下调（P 均＜ 0.001），剪切型 PARP 蛋白的表达水平明显提高（P ＜0.05）。72 h时，LATS/YAP通路中LATS1（P ＜0.05）和YAP1（P ＜0.001）蛋白的表达水平均明显下调。48 h 时 DLD-1 细胞的线粒体膜电位水平降低（P ＜ 0.05），同时 PRKN 蛋白的表达水平增加（P ＜ 0.05），并且观察到 24 h 时 LC3- Ⅱ蛋白的表达水平增加（P ＜ 0.05）和 p62 蛋白的表达水平降低（P ＜ 0.01）。RASSF1A 过表达抑制了 DLD-1 细胞的增殖（P 均＜ 0.01），同时下调 RAS 和 RAF 蛋白的表达水平（P ＜ 0.001）。同时，48 h 时 PI3K、p-PI3K 以及其下游的 mTOR、p-mTOR 蛋白的表达水平下调（P 均＜ 0.01）。48 h 时，RASSF1A 过表达能够下调 β-actin 蛋白的表达水平（P ＜ 0.01），同时下调 β-连环蛋白（β-catenin）和黏着斑蛋白（vinculin）蛋白的表达水平（P 均＜ 0.01）。

  结论 ：RASSF1A 通过促进结直肠癌 DLD-1 细胞的凋亡和线粒体自噬以及抑制其增殖和细胞黏附而发挥抑癌作用。
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  长链非编码RNA RPPH1靶向miR-143-3p在非小细胞肺癌中的作用机制

  薛国亮, 张　聪, 郑桂丽, 王　俊

  肿瘤. 2021, 41(10): 684-695. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2021.2010-0925

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  目的 ：探讨长链非编码 RNA（long non-coding RNA，LncRNA）核糖核酸酶 P RNA 组分 H1（ribonuclease P RNA component H1，RPPH1）通过调控微 RNA（microRNA，miR）-143-3p 对非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）细胞增殖和凋亡的影响。

  方法 ：实时荧光定量 PCR 法检测 35 例 NSCLC 组织及其配对癌旁组织、NSCLC 细胞 Calu-3 和 A549 以及正常人支气管内皮 HBE 细胞中 RPPH1 的表达水平。分别将 shNC（对照组）和 shRPPH1（shRPPH1 组）转入 Calu-3 细胞和 A549 细胞后，分别采用克隆形成实验和 CCK-8 法检测细胞的增殖情况，FCM 法检测细胞的凋亡率，蛋白质印迹法检测细胞增殖相关蛋白细胞周期蛋白 B1（cyclin B1）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、凋亡相关蛋白 Bax 和剪切型（cleaved）-caspase 3 的表达水平。使用 TargetScan 预测 RPPH1 与 miR-143-3p 的互补结合位点，采用双荧光素酶报告基因系统验证 2 者的靶向关系。为进一步验证 2 者的调控关系，在 Calu-3 和 A549 细胞中同时转入 shRPPH1 和 miR-143-3p- 抑制子（inhibitor）以调控 RPPH1 和 miR-143-3p 的表达水平，再分别采用克隆形成实验、CCK-8 法和 FCM 法检测下调 RPPH1 和 miR-143-3p 表达对 NSCLC 细胞增殖及凋亡的影响，最后采用蛋白质印迹法检测 cyclin B1、PCNA、Bax 和 cleaved-caspase 3 的表达水平。

  结果 ：NSCLC 组织中 RPPH1 的表达水平明显高于癌旁组织（P ＜ 0.05）。与 HBE 细胞相比，Calu-3 和 A549 细胞中 RPPH1 的表达水平明显提高（P 均＜ 0.05）。相较于 shNC 组，用 shRPPH1 沉默 Calu-3 和 A549 细胞中 RPPH1 的表达水平后，细胞的增殖活力和克隆形成数均明显被抑制（P 均＜ 0.05），细胞的凋亡率明显提高（P ＜ 0.05）；增殖相关蛋白 cyclin B1 和 PCNA 蛋白的表达水平均明显下调（P 均＜ 0.05），而凋亡相关蛋白 Bax 和 cleaved-caspase 3 蛋白的表达水平均明显上调（P 均＜ 0.05）。双荧光素酶报告基因实验证实 RPPH1 可以负调控 miR-143-3p。相较于 shRPPH1 ＋ NC-mimics 组，shRPPH1 ＋ miR-143-3p-inhibitor 组的 Calu-3 和 A549 细胞的增殖活力和克隆形成数明显增加（P 均＜ 0.05），细胞的凋亡率则明显降低（P 均＜ 0.05）；cyclin B1 和 PCNA 蛋白的表达水平明显上调，Bax 和 cleaved-caspase 3 蛋白的表达水平则明显下调（P 均＜ 0.05）。

  结论 ：RPPH1 可以通过负调控 miR-143-3p 促进 NSCLC 细胞的增殖并抑制细胞凋亡。
基础研究
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  沉默甲基转移酶样7B基因表达抑制肾母细胞瘤细胞的增殖、侵袭和迁移

  王仲秋, 耿　莉, 李承学, 郝希伟

  肿瘤. 2021, 41(10): 696-705. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2021.2011-1025

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  目的 ：探讨甲基转移酶样 7B（methyltransferase-like 7B，METTL7B）与肾母细胞瘤患者预后的关系，以及沉默 METTL7B 基因对肾母细胞瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响。

  方法 ：采用免疫组织化学法检测 72 例肾母细胞瘤组织及其配对的癌旁正常肾组织中 METTL7B 的表达情况 ；蛋白质印迹法检测人肾母细胞瘤 SK-NEP-1 细胞和正常肾上皮细胞系（PCS-400-010、PCS-400-011 和 PCS-400-012）中 METTL7B 的表达水平。分析 METTL7B 与肾母细胞瘤患者临床病理特征和生存的关系，应用 Kaplan-Meier 法和 COX 比例风险回归模型分析预后相关因素。采用脂质体转染法将特异性针对 METTL7B 基因的 siMETTL7B 及阴性对照（negative control，NC）siRAN（siNC）瞬时转入 SK-NEP-1 细胞，然后采用蛋白质印迹法检测沉默效率 ；随后分别采用克隆形成实验、CCK-8 法、FCM 法、Transwell 小室实验以及细胞划痕实验检测沉默 METTL7B 表达对 SK-NEP-1 细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。

  结果 ：肾母细胞瘤组织中 METTL7B 的表达率为 68.06%（49/72），高于癌旁正常肾组织中的 16.67%（12/72）（P ＜ 0.05）。与 SK-NEP-1 细胞相比，PCS-400-010、PCS-400-011 和 PCS-400-012 细胞中 METTL7B 蛋白的表达水平均较低（P 均＜ 0.05）。METTL7B 与肾母细胞瘤的美国儿童肿瘤协作组（Children’s Oncology Group，COG）分期有关（P ＜ 0.05），与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径和病理分型无关（P 均＞ 0.05）。COX多因素分析结果显示，COG 分期为Ⅲ～Ⅳ期、病理分型为 UFH 型和METTL7B 高表达是肾母细胞瘤预后不良的独立影响因素（P 均＜ 0.05）。Kaplan-Meier 生存曲线分析结果显示，METTL7B 高表达患者的总生存时间短于 METTL7B 低表达患者（P ＜ 0.05）。在 SK-NEP-1 细胞中沉默METTL7B 基因表达后，SK-NEP-1 细胞的克隆形成能力、增殖能力、侵袭能力和细胞迁移能力均受到明显抑制（P 均＜ 0.05），而细胞凋亡率明显提高（P ＜ 0.05）。

  结论 ：METTL7B 与肾母细胞瘤分期和不良预后相关。沉默 METTL7B 基因表达可抑制肾母细胞瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，并促进其凋亡。
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  大蒜素抑制人胆囊癌NOZ细胞的增殖、侵袭并诱导其凋亡

  李俊杰, 邬海峰, 张东明, 张志平, 陆赪阳, 刘　波, 李明章

  肿瘤. 2021, 41(10): 706-714. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2021.2011-1004

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  目的 ：探索中药提取物大蒜素对人胆囊癌 NOZ 细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响，以及可能的作用机制。

  方法 ：用不同浓度的大蒜素处理 NOZ 细胞后，采用 CCK-8 法和平板克隆形成实验检测 NOZ 细胞的活性和增殖能力 ；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的 Annexin Ⅴ（Annexin Ⅴ -FITC）/ 碘化丙啶（propidium iodide，PI）双染 FCM 法和 Hoechst 33342 染色法检测 NOZ 细胞凋亡情况 ；FCM 法检测 NOZ 细胞周期分布的变化 ；Transwell 小室实验检测 NOZ 细胞侵袭能力。采用蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白剪切型 - 聚腺苷二磷酸 - 核糖聚合酶（cleaved-polyadenosine diphosphate ribose polymerase，cleaved-PARP）、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9、Bcl-2、Bax、细胞周期相关蛋白周期蛋白依赖性激酶 1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）、细胞周期蛋白 B1（cyclin B1）、侵袭相关蛋白 E- 钙黏蛋白（E-cadherin）、N- 钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（vimentin）表达的变化。

  结果 ：与对照组相比，大蒜素终质量浓度为 40、80 和 120 μg/mL 时均可以抑制 NOZ 细胞的活性和增殖能力（P 均＜ 0.05）。大蒜素可有效促进 NOZ 细胞发生凋亡（P ＜ 0.05），并且将细胞周期阻滞于 G2/M 期（P ＜ 0.001），还可有效抑制 NOZ 细胞的侵袭能力（P ＜ 0.05）。蛋白质印迹法检测结果显示，大蒜素可上调 NOZ 细胞中促凋亡蛋白 cleaved-PARP、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9 和 Bax 的表达水平（P 均＜ 0.001），下调抑凋亡蛋白 Bcl-2 的表达水平 ；下调细胞周期相关蛋白 CDK1 和 cyclin B1 的表达水平（P 均＜ 0.05）；上调侵袭蛋白 E-cadherin 的表达，下调 N-cadherin 和 vimentin 的表达（P 均＜ 0.001）。

  结论 ：大蒜素能够抑制人胆囊癌 NOZ 细胞的增殖和侵袭能力，并且诱导其发生凋亡。
综述
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  RNA甲基化修饰在乳腺癌中的研究进展

  李　明, 赵　远, 陈　丽, 马　萍, 袁　超, 袁红军, 唐文如, 盛苗苗

  肿瘤. 2021, 41(10): 715-723. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2021.2101-0035

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  乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。晚期乳腺癌往往伴随转移，治疗效果不理想，并且具有较高的复发率和死亡率。因此，探索新的用于诊断和预测乳腺癌预后的分子标志物以及新的治疗策略成为研究热点。近年来，RNA 甲基化修饰正逐渐成为恶性肿瘤的又一个研究热点。因此本文将就RNA 甲基化修饰及其甲基化酶参与调控乳腺癌细胞增殖、侵袭、转移和耐药的研究进展作一综述，以期为乳腺癌 RNA 甲基化修饰的研究提供参考资料和新的思路，以及为乳腺癌的诊断、治疗和预后监测提供新的策略。
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  Serpin B9与肿瘤及肿瘤干细胞的研究进展

  王文君, 王　娇, 叶小群

  肿瘤. 2021, 41(10): 724-732. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2021.2101-0059

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  丝氨酸蛋白酶抑制剂 B9（serine proteinase inhibitor B9，Serpin B9）是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员之一，广泛存在于动物、植物和微生物体内，其通过抑制淋巴细胞释放颗粒酶 B 的杀伤作用而保护细胞。研究表明，Serpin B9 参与调节机体免疫、凝血和炎性反应等病理和生理过程，并且与痴呆、肝硬化、肺气肿以及肿瘤等疾病的发生和发展密切相关。近年来越来越多的研究认为，Serpin B9 能够调控肿瘤细胞凋亡、肿瘤免疫、肿瘤发生和发展、肿瘤转移以及肿瘤耐药，并且能够维持肿瘤干细胞的干性，与肿瘤患者的不良预后明显相关。因此，Serpin B9 可能成为潜在的肿瘤治疗靶点以及肿瘤诊断和预后判断的指标。本文旨在介绍 Serpin B9 的结构及其生物学功能，重点阐明其在肿瘤及肿瘤干细胞中的研究进展，以期更全面地了解 Serpin B9 促进肿瘤进展的机制及其对肿瘤诊断治疗的临床意义。