2022年, 第42卷, 第02期　刊出日期：2022-02-25

  

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原创研究
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  SMAD1通过调控miR-32表达影响结直肠癌细胞增殖、凋亡和迁移

  陈永泽, 周　宇, 杨　慧, 李晓文, 丁元林, 吴巍芸

  肿瘤. 2022, 42(02): 77-92. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2022.2012-1148

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  目的：研 究 SMAD 家族成员 1（SMAD family member 1，SMAD1） 通过调控微 RNA（microRNA，miRNA，miR）-32 对结直肠癌（colorectal cancer，CRC）细胞增殖、凋亡和迁移等生物学行为的影响，并探讨可能的作用机制。

  方法：实时荧光定量 PCR 法检测 SMAD1 在 CRC 细胞 HCT-8、HCT-116 和 HT-29 以及正常结肠上皮细胞株 NCM460 中的表达水平。采用脂质体法分别将特异性针对 SMAD1 基因的 siRNA（siSMAD1）和 siRNA- 阴性对照（negative control，NC）（siNC）转染至人 CRC 细胞 HCT-116 中，用实时荧光定量 PCR 和蛋白质印迹法检测沉默效果。分别采用 CCK-8 法、FCM 法、划痕愈合实验和 Transwell 小室实验检测沉默 SMAD1 表达对细胞增殖、凋亡和迁移的影响 ；实时荧光定量 PCR 法和蛋白质印迹法检测沉默 SMAD1 表达对 HCT-116 细胞中 miR-32 及其宿主基因 TMEM245 及靶基因 PTEN 表达的影响 ；实时荧光定量 PCR 法检测上皮 - 间质转化相关因子波形蛋白（Vimentin）、E- 钙黏蛋白（E-cadherin）和 N- 钙黏蛋白（N-cadherin）mRNA 的表达水平。采用染色质免疫共沉淀法检测 SMAD1是否能直接与 TMEM245/miR-32 的启动子区相结合。分别将 miR-32- 模拟物（miR-32-mimics）以及阴性对照 - 模拟物（NC-mimics）转入 HCT-116 细胞，采用实时荧光定量 PCR 法检测转染效率和 SMAD1 的表达水平。分别同时共转染 siSMAD1 ＋ miR-32-mimics 以及 siSMAD1 ＋ NC-mimics至 HCT-116 细胞，采用 CCK-8 法、FCM 法、划痕愈合实验和 Transwell小室实验分别检测共转染后细胞增殖、凋亡和迁移能力的改变，实时荧光定量 PCR 法和蛋白质印迹法检测转染后对 PTEN 和上皮 - 间质转化相关因子表达的影响。

  结果：CRC 细胞 HCT-8、HCT-116 和 HT-29 中 SMAD1 mRNA 的表达水平均高于正常结肠上皮细胞株 NCM460 细胞（P 均＜ 0.05）。siSMAD1转入 HCT-116 细胞后，HCT-116 细胞中 SMAD1 mRNA 和蛋白的表达水平均明显下调（P 均＜ 0.05）。沉默 SMAD1 基因表达后，HCT-116 细胞的增殖和迁移能力均被抑制，而凋亡率明显增加（P 均＜ 0.05），miR-32 和TMEM245 mRNA 的表达水平下调，PTEN mRNA 和蛋白表达水平上调（P 均＜ 0.05），Vimentin和 N-cadherin mRNA 的表达下调，E-cadherin mRNA 表达上调（P 均＜ 0.05）。染色质免疫共沉淀结果显示，SMAD1 能与 TMEM245/miR-32 核心启动子区相结合（P ＜ 0.05）。与 siSMAD1 ＋NC-mimics 共转染组相比，siSMAD1 ＋ miR-32-mimics 共转染组细胞增殖、迁移能力增强，凋亡率减少，PTEN 蛋白表达水平下调，Vimentin 和 N-cadherin mRNA 的表达上调，E-cadherin mRNA表达下调（P 均＜ 0.05）。

  结论：沉默 SMAD1 表达可通过下调 miR-32 表达来上调 PTEN 的表达水平，进而抑制 CRC 细胞的增殖和迁移能力，促进细胞凋亡。
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  miR-103/MTHFR轴抑制肝细胞癌中LINE-1基因的甲基化水平

  刘玉玲, 梁顺顺, 徐慧莉, 胡晶莹, 张源洲, 罗晓莹

  肿瘤. 2022, 42(02): 93-107. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2022.2012-1124

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  目的：研究肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）组织中长散在核元件 1（long interspersed nuclear element-1，LINE-1）基因的甲基化状态，并探讨调控 DNA 整体甲基化的可能因素。

  方法：使用 Taqman 实时荧光定量 PCR 方法检测 LINE-1 基因的甲基化水平，用实时荧光定量 PCR 检测微 RNA（microRNA，miRNA，miR）-103和亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）mRNA 的表达水平，采用蛋白质印迹法和免疫组织化学法检测 MTHFR 蛋白的表达水平。利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库，分析 HCC 组织中不同 miRNA 的表达水平，利用 miRDB 等靶基因预测数据库预测 miR-103 的靶基因，采用荧光素报告基因实验检验 miR-103 与其靶基因 MTHFR 的直接相互作用。将 miR-103-mimics、miR-103-inhibitor 及各自阴性对照（negative control，NC）或过表达 miR-103/MTHFR 慢病毒颗粒转入肝癌 BEL-7402 细胞中，检测不同处理对 LINE-1基因甲基化的影响。

  结果：HCC 组织中 LINE-1 基因甲基化水平较癌旁组织下降，且这种低甲基化与预后差相关。TCGA 数据库分析结果显示，miR-103 是 HCC 组织中高表达且表达上调的 miRNA 之一，miR-103 表达高的患者较表达低者预后差，这种表达上调在 176 例患者的样本中得到验证。miR-103 过表达可直接抑制 MTHFR 的表达，导致 LINE-1 基因甲基化水平降低。HCC 患者癌组织较癌旁对照组织的 MTHFR mRNA 和蛋白水平降低。MTHFR 过表达的细胞中 LINE-1 基因甲基化水平升高。

  结论：LINE-1 基因的甲基化水平受 miR-103/MTHFR 轴调控，在 HCC组织中降低且与患者预后相关；miR-103 在 HCC 组织中高表达，提示miR-103/MTHFR/DNA 整体甲基化可能是 HCC 进展中的重要变化过程。
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  4EGI-1通过下调Bcl-2诱导K-RAS基因突变型结直肠癌细胞凋亡

  艾　静, 姬光瑜, 谢明路, 马其钊, 马岩林, 郭素堂, 王玉芳

  肿瘤. 2022, 42(02): 108-119. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2022.2012-1087

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  目的：研究真核细胞翻译起始因子 4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）/eIF4G 相互作用抑制剂 4EGI-1 对 K-RAS 基因突变型及野生型结直肠癌（colorectal cancer，CRC）细胞 HCT116 和 DLD1 增殖和凋亡的影响，及可能的作用机制。

  方法：采用 MTT 法和 FCM 法检测不同浓度的 4EGI-1 对 K-RAS 基因变型及野生型 HCT116 和 DLD1 细胞（HCT116^KRASG13D、HCT116^KRASWT、DLD1^KRASG13D 和 DLD1^KRASWT）增殖及凋亡率的影响 ；蛋白质印迹法检测4EGI-1 对 HCT116^KRASG13D 和 HCT116^KRASWT细胞中凋亡相关蛋白 caspase3和 cleaved-caspase3 及其底物多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly adenosine diphosphate-ribose polymerase，PARP） 和 cleaved-PARP，以及 Bcl-2 家族 中 Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、Bim、Noxa 和 Puma 表达水平的影响。采用慢病毒感染的方法将特异性针对 Bcl-2 基因的 shRNA（shBcl-2）转入HCT116^KRASWT细胞，随后用蛋白质印迹法检测 Bcl-2 的敲减效率。再用MTT 法和 FCM 法检测 4EGI-1 对敲减 Bcl-2 表达后 HCT116^KRASWT细胞增殖及凋亡的影响，并用蛋白质印迹法检测其对 HCT116^KRASWT细胞中凋亡相关蛋白 PARP 和 cleaved-PARP 表达水平的影响。

  结果：4EGI-1 能明显抑制 HCT116^KRASG13D、HCT116^KRASWT、DLD1^KRASG13D和 DLD1^KRASWT 细胞的增殖并呈一定的剂量相关性（P ＜ 0.05），且 4EGI-1对 K-RAS 基因突变细胞增殖的抑制作用大于其对 K-RAS 基因野生型细胞增殖的抑制作用（P ＜ 0.05）。4EGI-1 能明显促进 HCT116^KRASG13D、HCT116^KRASWT、DLD1^KRASG13D 和 DLD1^KRASWT 细 胞 的 凋 亡（P ＜ 0.05），且 K-RAS 基因突变型 CRC 细胞的凋亡率明显高于 K-RAS 基因野生型细胞（P ＜ 0.05）。 蛋白质印迹法检测结果显示，4EGI-1 能明显上调 HCT116^KRASG13D 和 HCT116^KRASWT 细胞中 cleaved-caspase3 和 cleaved-PARP 蛋白的表达水平（P ＜ 0.05）， 且 4EGI-1 作用后明显地降低了HCT116^KRASG13D 细胞中抑凋亡蛋白 Bcl-2 的表达水平（P ＜ 0.05）。Bcl-2在 HCT116^KRASWT 细胞中的表达水平明显高于其在 HCT116^KRASG13D 细胞中的表达水平（P ＜ 0.05），敲减 Bcl-2 基因表达后，与对照组相比，HCT116^KRASWT 对 4EGI-1 抑制增殖和诱导凋亡的敏感度增加（P ＜ 0.05）。

  结论： 4EGI-1 能通过降低 Bcl-2 表达抑制 K-RAS 基因突变型 CRC 细胞的增殖并诱导其凋亡。本研究为 4EGI-1 作为潜在靶向药物在临床上对结直肠癌根据分子分型进行个体化治疗提供了理论基础。
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  微RNA-181靶向DEK基因调控甲状腺髓样癌细胞的增殖、侵袭及凋亡

  赵旭东, 张　薇

  肿瘤. 2022, 42(02): 120-132. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2022.2104-0225

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  目的：探讨微 RNA（microRNA，miR）-181 在甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）进展和转移中的作用及可能的作用机制。

  方法：采用实时荧光定量 PCR 和蛋白质印迹法检测 38 例 MTC 及其癌旁组织 miR-181 和 DEK 蛋白的表达水平，以及 MTC 细胞 TT 和正常甲状腺细胞 Nthy-ori 3-1 中 miR-181 和 DEK 蛋白的表达水平。分析 MTC 临床病理特征与 miR-181 表达的相关性。采用瞬时转染的方法将 miR-181- 模拟物（mimics）转入 MTC 细胞 TT 和 MZ-CRC-1，分别采用 CCK- 法、Transwell 小室实验和 FCM 法检测 miR-181 过表达对 MTC 细胞增殖、侵袭及凋亡的影响，以及对凋亡相关蛋白 caspsae-3 活性的影响。用生物信息学软件（miRanda、TargetScan 和 PicTar）预测 miR-181 的靶基因，并行双荧光素酶报告基因实验予以验证。将 DEK 过表达（overexpression，OE）重组质粒和 miR-181-mimics 共转入 TT 和 MZ-CRC-1 细胞，再用 CCK- 法、Transwell 小室实验以及 FCM 法检测 DEK 过表达对 miR-181 过表达导致的TT 和 MZ-CRC-1 细胞增殖及侵袭能力降低以及细胞凋亡能力提高的影响。

  结果：MiR-181 在 MTC 组织中的表达水平较癌旁正常甲状腺组织明显下调（P ＜ 0.001），DEK 蛋白在 MTC 组织中的表达水平较癌旁正常甲状腺组织明显下调提高（P ＜ 0.001），且两者呈负相关。MiR-181 的表达水平和 TNM 分期和颈部淋巴结转移明显相关（P 均＜ 0.05）。miR-181 过表达能够明显抑制 TT 和 MZ-CRC-1 的细胞增殖和侵袭能力（P 均＜ 0.05），并促进细胞凋亡（P 均＜ 0.05）。双荧光素酶报告基因实验验证确认，DEK是 miR-181 的靶基因。DEK 的过度表达可以逆转 miR-181 过度表达对细胞增殖、侵袭和凋亡的影响（P 均＜ 0.05）。

  结论：MiR-181 通过下调 DEK 表达抑制 MTC 的进展，miR-181 可能是MTC 的一个潜在治疗靶点。
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  沉默ACSL1表达抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的脂肪代谢及增殖和迁移

  叶　力, 刘红梅, 吴佳伟, 刘培峰

  肿瘤. 2022, 42(02): 133-143. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2022.2104-0234

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  目的：研究抑制长链脂酰辅酶 A 合成酶 1（long-chain acyl-CoA synthetase 1，ACSL1）表达对三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）细胞脂肪代谢的影响，并探讨其抑制 TNBC 细胞增殖和迁移等恶性表型的作用。

  方法：利用癌症基因图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库探究并分析 ACSL1 与乳腺癌预后的相关性，并对比不同乳腺癌亚型中ACSL1 表达量的差异。在供给棕榈酸（palmitic acid，PA）的条件下培养TNBC 型 MDA-MB-231 细胞和雌激素受体阳性的乳腺癌 MCF-7 细胞，并采用 ATP 生物发光法检测 PA 对细胞 ATP 产量的影响，以评估不同亚型乳腺癌细胞对脂肪酸代谢的偏好 ；同时采用 CCK-8 法检测 PA 对细胞活性的影响。为评估抑制 ACSL1 表达对 TNBC 型 MDA-MB-231 细胞脂肪酸代谢的影响，采用慢病毒感染的方法在 MDA-MB-231 细胞中沉默 ACSL1的表达，随后采用蛋白质印迹法检测细胞中脂肪酸代谢相关蛋白 ACSL1、肉毒碱棕榈酰转移酶 1A（carnitine palmitoyltransferase 1A，CPT1A）以及白细胞分化抗原 CD36 的表达水平 ；采用 BODIPY 脂肪荧光染色法检测细胞内的脂肪积累情况，采用划痕愈合实验检测细胞的迁移能力，CCK-8 法和克隆形成实验检测细胞的增殖能力。

  结果：ACSL1 高表达的乳腺癌患者的生存率明显低于 ACSL1 低表达者（P ＝ 0.000 14），且 HER2 过表达型和 TNBC 型患者中 ACSL1 的表达水平均高于 Luminal A 和（或）B 型患者（P 均＜ 0.001）。在给予 PA 处理后，MDA-MB-231 细胞中相对 ATP 产量及细胞活性均较未用 PA 处理的细胞明显提高（P 均＜ 0.05），而对 MCF-7 细胞中 ATP 产量及细胞活性则无明显影响（P 均＞ 0.05）。在 MDA-MB-231 细胞中沉默 ACSL1 表达后，细胞中脂肪酸代谢相关蛋白 ACSL1、CPT1A 以及 CD36 的表达水平下调，细胞内脂滴积累及脂肪含量降低，细胞迁移能力降低（P ＜ 0.001），细胞增殖能力减弱（P ＜ 0.05）。

  结论：ACSL1 高表达与乳腺癌的不良预后相关。在各乳腺癌亚型中，TNBC 患者具有相对较高的 ACSL1 表达水平。对于具有脂肪酸代谢偏好的 TNBC 细胞 MDA-MB-231，沉默其 ACSL1 表达可抑制其脂肪酸代谢，并降低其细胞迁移和增殖能力。
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  三氧化二砷通过FOXO3a/cofilin-1通路调控肺腺癌A549细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力

  韩燕燕, 郑　旭, 李　翀, 吕　艳

  肿瘤. 2022, 42(02): 144-155. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2022.2104-0194

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  目的：研究三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）对肺腺癌 A549 细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响，及可能的作用机制。

  方法 ：用不同浓度的 ATO 处理肺腺癌 A549 细胞后，采用 CCK-8 法检测ATO 对 A549 细胞增殖的影响，以及蛋白质印迹法检测 ATO 对 A549 细胞核和细胞质中 FOXO3a 蛋白表达水平的影响。采用 siRNA 干扰的方法下调 A549 细胞中 FOXO3a mRNA 和蛋白的表达水平，随后分别采用流式细胞术（flow cytometry，FCM）、细胞划痕愈合实验及 Transwell 小室实验检测 ATO 单药处理、沉默 FOXO3a 表达、沉默 FOXO3a 表达联合 ATO 处理以及 LY294002 单药处理对 A549 细胞凋亡、迁移及侵袭能力的影响，最后再用蛋白质印迹法检测对 A549 细胞中丝切蛋白 1（cofilin-1）及磷酸化cofilin-1（phosphorylated cofilin-1，p-cofilin-1）蛋白表达水平的影响。

  结果：ATO 能抑制 A549 细胞的增殖（P ＜ 0.05），且随着 ATO 浓度的升高，细胞核中 FOXO3a 蛋白的表达水平显著升高（P ＜ 0.01），细胞质中 FOXO3a 蛋白的表达水平显著降低（P ＜ 0.01）。ATO 和 LY294002 都能显著提高 A549 细胞的凋亡率（P 均＜ 0.05），而抑制 A549 细胞的迁移及侵袭能力（P 均＜ 0.05）；沉默 FOXO3a 表达后，A549 细胞的凋亡率显著降低（P ＜ 0.01），细胞的迁移及侵袭能力则显著提高（P 均＜ 0.05）；ATO 能部分逆转沉默 FOXO3a 表达导致的 A549 细胞的凋亡率的降低（P ＜ 0.05），以及细胞的迁移及侵袭能力的提高（P 均＜ 0.05）。蛋白质印迹法检测结果提示，ATO 和 LY294002 都能显著下调 A549 细胞中 p-cofilin-1蛋白的表达水平（P 均＜ 0.05），沉默 FOXO3a 表达后细胞中 p-cofilin-1 蛋白的表达水平显著上调（P ＜ 0.01），ATO 能部分逆转沉默 FOXO3a 表达导致的 p-cofilin-1 蛋白表达水平的上调（P ＜ 0.01）。所有分组中 cofilin-1蛋白的表达水平未发生变化。

  结论：ATO 能明显抑制 A549 细胞的增殖、迁移及侵袭，并促进细胞的凋亡，FOXO3a 可能为 ATO 抑制肺癌恶性进展的一个潜在靶点，且 FOXO3a 可能通过激活 cofilin-1 的磷酸化发挥抑癌作用。
综述
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  UHRF1在恶性肿瘤发生和发展中的作用及其靶向治疗的研究进展

  陈锦远, 张恩承, 袁智浩, 王　翔

  肿瘤. 2022, 42(02): 156-164. https://doi.org/10.3781/j.issn.1000-7431.2022.2102-0096

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  泛素样含 PHD 和环指域 1（ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1，UHRF1）在多种肿瘤细胞中高表达，被认为是普遍的肿瘤标志物，其与肿瘤的发生和发展密切相关。在肿瘤细胞中，UHRF1 通过调控细胞周期和 DNA 修复，以及 DNA 甲基化修饰沉默抑癌基因等途径促进肿瘤细胞的增殖和转移。UHRF1 共有 5 个结构域（SRA、TTD、PHD、RING和 UBL），各个结构域都具有重要功能，因此靶向 UHRF1 的不同结构域开发新型临床治疗方案具备相当的潜力。目前，靶向 SRA 结构域的潜在抑制剂已报道有 NSC232003 和 UM63，靶向 TTD 结构的潜在抑制剂已报道有 BPC、NV01、2，4- 二甲基砒啶和小檗碱，另有多种天然化合物也能够下调 UHRF1 的水平。因此，本文将就 UHRF1 的结构与功能、UHRF1 参与肿瘤的发生和发展及其靶向治疗中的研究进展作一综述，以期推动靶向UHRF1 的新型肿瘤治疗的研发。