王转兄, 李海龙, 吴建军, 呼永华, 许丽丽, 何 华, 韩 静
目的：研究沉默 Kelch 样家族成员 7（kelch like family member 7，KLHL7）基因表达对人胃癌细胞生物学表型（细胞增殖、凋亡及迁移）的影响，及可能的作用机制。
方法：采用阿拉巴马大学伯明翰分校癌症数据分析数据库（The University of Alabama at Birmingham Cancer Data Analysis Portal，UALCAN）和基因表达谱交互分析数据库（Gene Expression Profiling Interactive Analysis GEPIA）分析 KLHL7 基因在人胃癌和癌旁组织中的差异表达以及与胃癌患者临床病理特征之间的关系，并采用 Human Protein Atlas 和 Kaplan-Meier 法分析 KLHL7 基因异常表达对胃癌患者总生存期的影响。采用实时荧光定量 PCR 和蛋白质印迹法检测 KLHL7 在正常胃黏膜上皮细胞与不同分化胃癌细胞中的表达水平，随后用慢病毒感染的方法将携带有的shKLHL7 的慢病毒载体转入胃癌细胞 HGC-27 和 MKN45，使 KLHL7基因沉默表达，再用实时荧光定量 PCR 和蛋白质印迹法检测沉默效率。MTT 法检测细胞增殖能力，细胞划痕愈合实验和 Transwell 小室实验检测细胞的迁移及侵袭能力，FCM 法检测细胞周期及凋亡率，最后用蛋白质印迹法检测细胞周期、凋亡、上皮 - 间质转化及磷脂酰肌醇 3- 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/ 蛋白激酶 B（protein kinase B ，PKB，又称 AKT）通路相关蛋白的表达情况。采用 BALB/c 裸鼠构建转入shKLHL7 的胃癌 MKN45 细胞的移植瘤模型，观察肿瘤在体内的生长情况，并使用实时荧光定量 PCR、蛋白质印迹法及免疫组织化学法验证目的基因 KLHL7 的表达情况。
结果：生信分析结果提示，KLHL7 基因在人胃癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织（P ＜ 0.05）。KLHL7 高表达者的总生存期明显短于低表达者（P＜ 0.05），且 KLHL7 高表达与胃癌患者的分级、分期、幽门螺旋杆菌感染、临床病理组织亚型及淋巴结转移等密切相关。KLHL7 在各组胃癌细胞中mRNA 和蛋白的表达水平均高于正常胃黏膜上皮细胞 GES-1（P 均＜ 0.05）。沉默 KLHL7 基因表达后，细胞增殖、侵袭和迁移能力明显降低（P ＜ 0.05）凋亡率提高（P ＜ 0.01），p21、Bax 和 E- 钙 黏 蛋 白（E-cadherin）表达水平升高，而周期蛋白依赖激酶 4（cyclin dependent kinase 4，CDK4）、CDK6、Bcl-2、波形蛋白（vimentin）、PI3K、AKT、磷酸化的 PI3K 和AKT 表达水平下调（P 均＜ 0.05）。体内研究提示，KLHL7 沉默后小鼠肿瘤体积和质量均明显降低（P 均＜ 0.01），实时荧光定量 PCR、蛋白质印迹法及免疫组织化学法检测结果表明，shRNA-KLHL7 可使组织内 KLHL7表达明显下调（P 均＜ 0.01）。
结论：沉默 KLHL7 基因表达可抑制人胃癌细胞的增殖、侵袭迁移能力，促进细胞凋亡并将细胞周期阻滞在 G1 期，其作用机制可能与抑制 PI3K-AKT 信号通路的磷酸化有关。
