目的：检测卵巢肿瘤（ovarian tumor，OTU）结构域线性链接特异性去泛素化酶（OTU domain deubiquitinase with linear linkage specificity，OTULIN）在胃癌组织中的表达情况，并探讨敲除 OTULIN 基因表达对胃癌 MKN45 和 AGS 细胞增殖的影响，及可能的作用机制。
方法：采用免疫组织化学法检测 73 例胃癌组织与 24 例正常胃黏膜组织中 OTULIN 的表达水平，分析 OTULIN 表达与胃癌临床病理特征和患者预后的相关性。收集并分析癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库和基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database，GEO）中的胃癌数据验证上述结论。采用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建敲除 OTULIN 表达的胃癌 MKN45 和 AGS 细胞并用蛋白质印迹法检测基因敲除效率 ；采用 CCK-8 法和软琼脂克隆检测敲除 OTULIN 表达对 MKN45 和 AGS 细胞增殖的影响。蛋白免疫沉淀 - 质谱技术筛选 OTULIN 和线性泛素分子（INT-Ub.7KR）的共同互作蛋白，发现线性泛素化修饰底物蛋白。利用丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）活性试剂盒检测敲除 OTULIN 表达后糖酵解限速酶的活性变化，乳酸定量试剂盒检测乳酸生成情况。最后采用免疫共沉淀及蛋白质印迹法验证 OTULIN 对底物蛋白线性泛素化作用。
结果：免疫组织化学法检测结果显示，OTULIN 在胃癌组织中的表达水平明显高于正常胃黏膜组织（P ＝ 0.004 1），肿瘤组织中 OTULIN 高表达者生存期较短（P ＝ 0.007 7）。TCGA 和 GEO 数据库数据分析也显示胃癌组织 OTULIN 表达水平升高（P ＜ 0.05），且 OTULIN 高表达与患者不良预后相关（P ＝ 0.011）。统计结果显示，OTULIN 高表达与 TNM 分期晚密切相关（P ＝ 0.027 3），预测患者较短生存期（P ＝ 0.04）。敲除 OTULIN 基因可显著抑制胃癌细胞的增殖能力（P 均＜ 0.001），降低胃癌细胞中 PK 活性和乳酸生成水平（P 均＜ 0.01）。OTULIN 可结合糖酵解途径的多个限速酶并下调它们的线性泛素化水平，包括丙酮酸激酶 M1（pyruvate kinase M1，PKM1）和 PKM2 以及乳酸脱氢酶 A（lactate dehydrogenase A，LDHA）和 LDHB。
结论：胃癌中 OTULIN 高表达可能是评估患者预后的一个新的生物标志物，OTULIN 可能通过下调糖酵解限速酶的线性泛素化修饰，激活胃癌糖酵解途径，促进胃癌发展。
目的：研究长链非编码 RNA（long non-coding RNA，LncRNA）GATA6反义 RNA1（GATA6 antisense RNA 1，GATA6-AS1）调控 GATA6 表达对胃癌（gastric cancer，GC）5- 氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）耐药细胞 SGC7901/5-FU 增殖、凋亡及转移的影响，并探讨可能的作用机制。
方法：以亲本 SGC7901 细胞和 SGC7901/5-FU 细胞作为对照组，采用 Lipofectamine 2000 将空载体 pcDNA3.1、重组载体 pcDNA3.1-GATA6-AS1、shNC 和 shGATA6-AS1 分别转入 SGC7901/5-FU 细胞，使 GATA6-AS1 过表达或沉默表达。采用实时荧光定量 PCR 法检测各组细胞中 GATA6-AS1 和 GATA6 mRNA 的表达情况。各组细胞经 5-FU 处理后，分别采用 CCK-8 法检测细胞增殖的能力，细胞划痕愈合实验检测细胞的迁移能力，Transwell 实验检测细胞的侵袭能力，FCM 法检测细胞的凋亡能力。随后采用蛋白质印迹法检测各组细胞中 Bax、Bcl-2、Caspase 3 和 GATA6 蛋白的表达水平，再用 α- 鹅膏菌素处理后的细胞用于检测 GATA6 mRNA 的稳定性 ；RNA pull-down 实验检测 GATA6-AS1 与 GATA6 之间的相关性。最后用 Balb/c 裸鼠建立 SGC7901 细胞移植瘤模型，分组与体外实验分组相同 ；经 5-FU 治疗后，观察各组裸鼠的肿瘤生长情况并计算抑瘤率。HE 染色后观察各组移植瘤组织病理学的变化情况，蛋白质印迹法检测各组裸鼠肿瘤组织中增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）蛋白的表达情况。
结果：经 5-FU 处理后，与亲本 SGC7901 细胞相比，SGC7901/5-FU 细胞中 GATA6-AS1 和 GATA6 mRNA 的表达水平明显下调（P 均＜ 0.05）；细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力均明显提高，细胞的凋亡能力明显降低（P 均＜ 0.05）；GATA6、Bax 和 Caspase 3 蛋白的表达水平均明显下调而 Bcl-2 蛋白的表达水平明显升高（P 均＜ 0.05）。与 SGC7901/5-FU-pcDNA 组相比，GATA6-AS1 过表达的 SGC7901/5-FU 细胞中相关指标与上述变化相反。与 SGC7901/5-FU-shNC 组相比，沉默 GATA6-AS1 表达的 SGC7901/5-FU 细胞中 GATA6-AS1 和 GATA6 mRNA 的表达水平明显下调（P 均＜ 0.05）；细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力均明显提高，细胞的凋亡能力明显降低（P 均＜ 0.05）；GATA6、Bax 和 Caspase 3 蛋白的表达水平均明显下调而 Bcl-2 蛋白的表达水平明显升高（P 均＜ 0.05）。GATA6-AS1 可增强 GATA6 mRNA 的稳定性，GATA6-AS1 正向调控 GATA6 的表达。体内实验检测结果显示，经 5-FU 治疗后，与亲本 SGC7901 细胞组相比，耐药 SGC7901/5-FU 细胞组小鼠的肿瘤体积、肿瘤组织中 PCNA 蛋白的表达水平显著增加（P 均＜ 0.05）；与 SGC7901/5-FU-pcDNA 组相比，SGC7901/5-FU-GATA6-AS1 组小鼠的肿瘤体积、肿瘤组织中 PCNA 蛋白的表达水平显著降低（P ＜ 0.05），肿瘤组织病理学观察发现 GC 发展程度较轻 ；与 SGC7901/5-FU-shNC 组相比，SGC7901/5-FU-shGATA6-AS1 组小鼠的肿瘤体积、肿瘤组织中 PCNA 蛋白的表达水平显著升高（P ＜ 0.05），GC 发展程度严重。
结论：GATA6-AS1 过表达后可促进 GATA6 的表达，抑制 GC 细胞的生长，从而逆转 SGC7901/5-FU 细胞对 5-FU 的耐药性。
目的：探讨去泛素连接酶 USP9X（deubiquitin ligase 9X）是否通过调控叉头框蛋白 M1（forkhead box M1，FOXM1）介导糖酵解从而影响鼻咽癌细胞的增殖能力。
方法：采用实时荧光定量 PCR 法和蛋白质印迹法检测鼻咽癌组织和正常鼻黏膜组织以及鼻咽癌细胞中 USP9X mRNA 和蛋白的表达情况。通过病毒感染的方法将携带有特异性针对 USP9X 基因的 shRNA（shUSP9X）和携带有 USP9X 全基因的重组质粒 Flag-USP9X（过表达 USP9X）分别转入鼻咽癌 CNE2 和 HNE2 细胞，采用 CCK-8 法检测沉默或过表达 USP9X 基因对鼻咽癌细胞增殖的影响，通过对细胞能量代谢和细胞外酸化率（extracellular acidification rate，ECAR）的检测分析对鼻咽癌细胞糖酵解能力的影响。通过 ubibrowser_v3/ 数据库、免疫共沉淀和 ZDOCK 软件分析 USP9X 与 FOXM1 蛋白的结合情况，并通过泛素化实验观察沉默 USP9X 对 FOXM1 蛋白泛素化水平的影响；随后进一步通过实时荧光定量 PCR 法和蛋白质印迹法检测对 FOXM1 mRNA 和蛋白表达的影响。最后，采用慢病毒感染的方法在沉默 USP9X 表达的 CNE2 细胞中同时转入重组载体 Flag-FOXM1 恢复 FOXM1 的表达，再通过 CCK-8 法、细胞能量代谢和 ECAR 检测分析上调 FOXM1 对 CNE2 细胞增殖和糖酵解能力的影响。
结果：与正常鼻黏膜组织相比，鼻咽癌组织中 USP9X mRNA 和蛋白的表达水平均显著提高（P 均＜ 0.05）。下调鼻咽癌 CNE2 细胞中 USP9X 的表达水平后，CCK-8 法、细胞能量代谢检测和 ECAR 实验检测发现，CNE2 细胞的增殖和糖酵解能力均被明显抑制（P 均＜ 0.05）。相反，上调 HNE2 细胞中 USP9X 的表达水平后，HNE2 细胞的增殖和糖酵解能力均被明显提高（P 均＜ 0.05）。通过ubibrowser_v3/ 数据库、免疫共沉淀和 ZDOCK 软件证实，USP9X 与 FOXM1 蛋白存在相互结合的关系，CNE2 细胞中沉默 USP9X 表达水平可显著增加 FOXM1 的泛素化水平。在低表达 USP9X 的 CNE2 细胞中过表达 FOXM1 可恢复鼻咽癌细胞的增殖和糖酵解能力（P 均＜ 0.05）。
结论：去泛素连接酶 USP9X 通过抑制 FOXM1 泛素化降解进而提高鼻咽癌细胞的糖酵解能力，最终促进鼻咽癌细胞的增殖。USP9X 可能是鼻咽癌治疗上一个潜在的新靶点。
目的：研究木犀草素（luteolin，Lut）对人耐多柔比星（adriamycin，ADR） 慢 性 髓 系 白 血 病（chronic myelogenous leukemia，CML）细胞 K562/ADR 增殖及铁死亡的影响，并探讨可能的作用机制。
方法：用不同浓度的 ADR 处理 K562 细胞和 K562/ADR 细胞， 采用 CCK-8 法检测 K562 细胞和 K562/ADR 细胞对 ADR 的敏感性；采用CCK-8 法检测不同浓度 Lut 对 K562/ADR 细胞增殖的影响，并计算半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）筛选出后续实验的药物浓度。不同浓度的 Lut 处理后，在倒置光学显微镜下观察细胞形态的变化；CCK-8 法检测 Lut 对 ADR 的增敏作用，FCM 法检测 Lut 对 K562/ADR 细胞凋亡的影响 ；随后再用荧光探针 DCFH-DA 检测细胞内活性氧（reactive oxygen specie，ROS）的含量，谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒检测各组细胞内 GSH 的含量 ；Fe2＋比色法检测各组细胞内 Fe2＋的含量，蛋白质印迹法检测各组细胞中谷胱甘肽过氧化物酶 4（glutathione peroxidase 4，GPX4）、核因子 E2 相关因子 2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）和血红素加氧 -1（heme oxygenase-1，HO-1）蛋白的表达量。CCK-8 法检测铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1（Fer-1）干预后 Lut 对 K562/ADR 细胞增殖、ROS 含量、GSH 含量、Fe2＋含量及 GPX4 表达量的影响。
结果：与 Lut（0 μmol/L）组相比，Lut 可显著抑制 K562/ADR 细胞增殖（P ＜ 0.001），提高 K562/ADR 细胞对 ADR 的敏感性（P ＜ 0.05）；Lut 可明显提高 K562/ADR 细胞的凋亡率（P ＜ 0.001）以及细胞中 ROS 的含量（P ＜ 0.05），同时降低 K562/ADR 细胞内 GSH 并提高 Fe2＋的含量（P ＜ 0.001 和 P ＜ 0.01）；与 Lut（0 μmol/L）组相比，细胞内 GPX4、Nrf2 和 HO-1 蛋白的表达量随 Lut 浓度的升高而降低（P 均＜ 0.05）；与 Lut 单药组相比，Fer-1 干预后可部分逆转 Lut 对 K562/ADR 细胞增殖的抑制作用（P ＜ 0.05），K562/ADR 细胞内 ROS 的含量降低（P ＜ 0.001），GSH 的水平升高（P ＜ 0.001），Fe2＋的含量降低（P ＜ 0.001），GPX4 蛋白的表达水平显著升高（P ＜ 0.01）。
结论：Lut 可通过铁死亡途径抑制 K562/ADR 细胞增殖，提高对 ADR 的敏感性，其机制可能与 Nrf2/HO-1 信号通路有关，这将为 Lut 通过铁死亡方式治疗白血病提供实验依据。
目的：探讨浸润性乳腺癌中肝配蛋白 A 型受体 2（ephrin A receptor 2，EphA2）表达及其启动子区 DNA 低甲基化与细胞焦亡发生的相关性。
方法：应用免疫荧光技术和蛋白质印迹法检测 42 例乳腺癌患者正常乳腺组织、癌旁组织和癌组织中 EphA2 的表达情况；采用免疫荧光技术和蛋白质印迹法检验细胞焦亡相关蛋白核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白 3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）的表达水平；采用蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白 Caspase 1 和炎性细胞因子白细胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）的表达水平；应用巢氏甲基化特异性 PCR（nested methylation-specific PCR，nMS-PCR）检验 EphA2 基因启动子区 DNA 甲基化水平；采用蛋白质印迹法测验 DNA 甲基转移酶 1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）和 DNA 甲基转移酶 3a（DNA methyltransferase 3a，DNMT3a）蛋白表达水平；应用 Pearson 相关系数分别对患者癌组织中 EphA2 的蛋白表达和甲基化水平与 NLRP3、Caspase 1、IL-1β、DNMT1 和 DNMT3a 进行相关性分析。
结果：与正常乳腺组织及癌旁组织相比，乳腺癌组中 EphA2 蛋白表达水平明显升高（P 均＜ 0.01），NLRP3、Caspase 1 和 IL-1β 的蛋白表达水平明显降低（P 均＜ 0.05）；同时与正常乳腺组织及癌旁组织相比，乳腺癌组织中 EphA2 基因启动子区 DNA 甲基化水平明显降低（P 均＜ 0.05），DNMT3a 蛋白表达明显降低（P ＜ 0.01，P ＜ 0.05）， 而 DNMT1 蛋白表达的差异未有统计学意义；Pearson 相关性分析结果显示，EphA2 蛋白 与 NLRP3 蛋 白（r ＝ －0.651 2，P ＜ 0.05）、Caspase 1 蛋 白（r ＝ －0.571 2，P ＜ 0.05）、IL-1 蛋 白（r ＝ －0.654 6，P ＜ 0.05） 和 DNMT3a 蛋白（r ＝－0.537 4，P ＜ 0.05）的表达水平均呈负相关性 ；而 EphA2 基因的甲基化水平与 NLRP3 蛋白（r ＝ 0.634 1，P ＝ 0.026 8）、Caspase 1 蛋白（r ＝ 0.672 8，P ＝ 0.016 5）、IL-1β 蛋白（r ＝ 0.694 0，P ＝ 0.012 3）和 DNMT3a 蛋白（r ＝ 0.687 1，P ＝ 0.013 6）的表达水平呈正相关性。
结论：乳腺癌组织中 EphA2 蛋白的表达水平上调并与细胞焦亡呈负相关性；DNMT3a 可能参与了 EphA2 基因启动子区发生 DNA 低甲基化的过程。
